Presentamos nuestro protocolo para producir inducida por progenitores eritroides (iEPs) de fibroblastos adultos ratón usando transcripción basada en el factor dirigen linaje reprogramación (DLR).
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Artículo de método
Directo linaje reprogramación de fibroblastos de ratón adulto a progenitores eritroides
En este artículo
Resumen
Resumen
Diferenciación y compromiso de la célula eritroide proceden a través de la activación de una red transcripcional restringida linaje orquestada por un grupo de destino de la célula determinar y factores de maduración. Nos propusimos previamente para definir el conjunto mínimo de factores necesarios para instruir el desarrollo de glóbulos rojos con linaje directo la reprogramación de fibroblastos en inducido progenitores/los precursores eritroides (iEPs). Hemos demostrado que la sobreexpresión de Gata1, Tal1, Lmo2y c-Myc (GTLM) pueden rápidamente convertir murinas y humanas fibroblastos directamente al iEPs que se asemejan a las células eritroides de bona fide en términos de morfología, fenotipo, y expresión génica. Pretendemos que el iEPs proporcionará una valiosa herramienta para estudiar la regulación sino la eritropoyesis y de la célula. Aquí describimos el proceso gradual de conversión de fibroblastos de ratón cola punta en iEPs mediante transcripción basada en el factor directo linaje reprogramación (DLR). En este ejemplo, realizamos la reprogramación de fibroblastos de ratones de seguimiento del linaje eritroide que expresan la proteína amarilla fluorescente (YFP) bajo el control del promotor del gene (EpoR) receptor eritropoyetina, lo que permite la visualización de células eritroides inducción de destino sobre la reprogramación. Siguiendo este protocolo, pueden ser reprogramados fibroblastos en iEPs dentro de cinco a ocho días.
Mientras que todavía pueden introducirse mejoras al proceso, mostramos que GTLM-mediada reprogramación es un proceso rápido y directo, produciendo células con propiedades de buena fe las células progenitoras y precursoras eritroides.
Introducción
Glóbulos rojos (gr) son esenciales en todos los vertebrados y conforman el 84% de todas las células del cuerpo humano1. De embrión a la vida adulta, nuestra salud es altamente dependiente de la exacta regulación de la homeostasis de la RBC. La continua producción de glóbulos rojos maduros en todo el desarrollo en la edad adulta se conoce como eritropoyesis. Un desafío importante en la investigación de la eritropoyesis es definir los principales reguladores que orquestan el desarrollo de la RBC y el interruptor entre eritropoyesis primitiva y definitiva. Reprogramación de linaje directo de progenitores eritroides presenta una oportunidad para en....
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Protocolo
1. establecimiento y mantenimiento de cola de ratón primaria punta culturas del fibroblasto
- Preparar platos de cubierta de gelatina (se recomienda un plato de 10 cm para una cola) que cubre la superficie con 0.1% gelatina e incubando los platos para unos 20 min a 37 ° C. Aspire la solución de gelatina del plato y deje que se seque durante al menos 2 h.
- Eutanasia a los ratones por dislocación cervical. Quitar la cola con las tijeras, corte en la base de la cola. Poner la cola en suero salino de Dulbecco tamponada con fosfato (DPBS) con 2% de suero bovino fetal (FBS) hasta que esté listo para usar.
Nota: Para mejores resultados, colas deben ser to....
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Resultados
Aquí presentamos un protocolo reproducible para la producción de iEPs de fibroblastos adultos usando transcripción factor-driven DLR. Evaluamos la reprogramación celular mediante citometría de flujo, formando Colonia ensayos y gen análisis de expresión. Para ayudar en la visualización de la conversión a destino de la célula eritroide, realizamos la reprogramación en fibroblastos de los ratones de seguimiento del linaje eritroide (Epor- Cre R26- eYFP) que expresan la prot.......
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Discusión
La sobreexpresión de un cóctel de cuatro factores, GATA1, TAL1, LMO2 y c-MYC (GTLM), es suficiente para reprogramar fibroblastos murinos y humanos directamente a iEPs10. Las células eritroides reprogramado mucho se asemejó a bona fide eritroides progenitores en cuanto a morfología, fenotipo, genes y capacidad formadora de colonias. Este hallazgo corrobora el fundamento de la utilizació.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de interés al informe.
Agradecimientos
Agradecemos a Evelyn Wang y Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge, MA) para clonación y Harvey Lodish (Whitehead Institute) para proporcionar muchos de la plásmidos utilizada para generar la biblioteca retroviral. Agradecemos a Kavitha Siva y Sofie Singbrant (Departamento de Medicina Molecular y genética Therapy, Universidad de Lund), Göran Karlsson y Shamit Soneji (Departamento de Hematología Molecular, Universidad de Lund) para sus funciones en la descripción de la iEP. También nos gustaría reconocer y agradecer a Julian Pulecio (centro de medicina regenerativa, Parque de investigación biomédica de Barcelona), Violeta rayón-Estrada (The Rockefeller University....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM sin piruvato de sodio | GE Life Sciences | SH30022.01 | Medios de cultivo para células PhGP |
| DMEM con piruvato de sodio | GE Life Sciences | SH30243.01 | Medios de cultivo para fibroblastos de la punta de la cola |
| StemSpan Medios de expansión libres de suero (SFEM) | Tecnologías de células madre | 9650 | Medios de reprogramación |
| Suero fetal bovino HyClone GE | Life Sciences | SH30071.03HI | Factor de crecimiento |
| Penicilina/Estreptomicina HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | antiboióticos |
| (100x) | Los medios Thermo Fisher | 11140050 | SNL se complementan con este |
| disociación celular | Trypsina HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 |
| Factor de Células Madre Murinas (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Añadido a los medios de reprogramación |
| Murine Recombinant Il-3 | Peprotech | 213-13 | Añadido a los medios de reprogramación |
| Eritropoyetina recombinante humana (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Añadido a los medios de reprogramación |
| Dexametasona | Sigma | 50-02-2 | Añadido a la reprogramación de medios |
| Gelatina de piel de cerdo | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled en dH2O y utilizado para el recubrimiento de placas. Asegurar la esterilidad antes de su uso. |
| Blasticidina S clorhidrato Sigma | 3/9/3513 | Antibiótico de selección. Afecta tanto a las células pro- como a las eucariotas | |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Utilizado para las etapas de lavado |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infección / Transfección Reactivo |
| FuGENE HD Reactivo de transfección | Promega | E2311 | Reactivo de transfección para la línea celular |
| PhGP Unidad de filtro de jeringa Millex-GP 0.22 y micro; m | Merck | SLGP033RS | Se utiliza para filtrar el sobrenadante |
| de virus BD Esmeralda Jeringa hipodérmica | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Se utiliza para filtrar el sobrenadante de virus |
| Placa de cultivo de 100 mm | Corning | 430167 | Placa de cultivo celular |
| 6 pocillos | Falcon | 10799541 | Cell |
| Culture Pinza de joyero #5 | Sklar | 66-7642 | Utilizado para manipulación de pequeños fragmentos de cola |
| Tijeras de iris Sklarlite | Sklar | 23-1149 | Se utiliza para cortar la cola en trozos pequeños |
| Kit de depleción de células de linaje, ratón | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Para la depleción de células hematopoyéticas en cultivos de fibroblastos |
| CD117 MicroBeads, ratón | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | Para la depleción de células hematopoyéticas en cultivos |
| de fibroblastosCélulas PheonixGP | ATCC | CRL-3215 | línea celular de empaquetamiento retroviral |
| vector EcoPAC (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | vector auxiliar retroviral que contiene genes gag y pol |
| pMX-Gata1 | Clonado en laboratorio | ||
| pMX-Tal1 | Clonado en laboratorio | ||
| pMX-Lmo2 | Clonado en laboratorio | ||
| pMX-cMyc | Clonado en laboratorio | ||
| Software CellSens Standard 1.6 | Software de análisis Cytospin |
Referencias
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M.
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Reimpresiones y permisos
