通过光谱学与扫描电子显微镜分析β-淀粉样蛋白诱导的纤维蛋白凝块结构异常

摘要

本文介绍了两种可单独或联合使用的方法，用于分析β-淀粉样蛋白对纤维蛋白凝块结构的影响。其中包括一种制备凝块的方案 体外 纤维蛋白凝块，随后进行凝块浊度测定和扫描电子显微镜分析。

摘要

本文介绍了生成方法 在 体外纤维蛋白凝块的制备及通过光谱法和扫描电子显微镜（SEM）分析β-淀粉样蛋白（Aβ）对凝块形成与结构的影响。在阿尔茨海默病（AD）中形成神经毒性淀粉样蛋白聚集体的Aβ已被证实可与纤维蛋白原相互作用。这种Aβ-纤维蛋白原相互作用导致纤维蛋白凝块结构异常，并对纤溶作用产生抵抗。Aβ诱导的纤维蛋白凝固异常还可能促进AD病理中的脑血管病变，如微梗死、炎症以及脑淀粉样血管病（CAA）。鉴于神经血管功能障碍在AD病理中可能具有的关键作用，开发能够抑制或减弱Aβ-纤维蛋白原相互作用的化合物具有良好的治疗前景。 体外 可用于简便、系统地评估纤维蛋白凝块形成的方法，对于开发治疗性化合物具有潜在应用价值。本文展示了一种优化的实验方案 体外 纤维蛋白凝块的生成，以及对 Aβ 和 Aβ-纤维蛋白原相互作用抑制剂效应的分析。凝块浊度检测法快速、高度可重复，可同时检测多种条件，适用于大规模筛选 Aβ-纤维蛋白原抑制剂。筛选获得的阳性化合物可进一步通过扫描电镜（SEM）评估其改善 Aβ 诱导的纤维蛋白凝块结构异常的能力。本文以近期发现的 Aβ-纤维蛋白原相互作用抑制剂 TDI-2760 为例，验证了这些优化方案的有效性。

引言

阿尔茨海默病（AD）是一种导致老年患者认知功能下降的神经退行性疾病，主要由异常的β-淀粉样蛋白（Aβ）表达、聚集以及清除障碍引发，最终导致神经毒性^1,2尽管Aβ聚集体与AD之间的关联已有充分表征³，但该疾病病理背后的精确机制尚未被充分阐明⁴越来越多的证据表明，神经血管功能障碍在阿尔茨海默病（AD）的进展和严重程度中起着重要作用。⁵，因为Aβ直接与循环系统的组分相互作用⁶Aβ 与纤维蛋白原具有高亲和力相互作用^7,8，该物质在阿尔茨海默病患者和小鼠模型的 Aβ 沉积中均有定位^9,10,11此外，Aβ与纤维蛋白原的相互作用会诱导异常的纤维蛋白凝块形成与结构改变，并导致对纤维蛋白溶解的抵抗性。^9,12一种治疗阿尔茨海默....

方案

1. Aβ42 和纤维蛋白原分析前的准备

1. 从冻干粉制备单体Aβ42
   1. 将 Aβ42 粉末恢复至室温，然后在 1,500 x g 条件下离心 30 秒。
   2. 每0.5 mg Aβ42粉末加入100 µL预冷的六氟异丙醇（HFIP），冰上孵育30分钟。
      警告：操作 HFIP 时需小心，并在通风橱中进行所有步骤。
   3. 制备20 µL分装液，在化学通风橱中风干2-3小时。薄膜可在-20 °C保存。
   4. 将单体Aβ42薄膜用10 µL新鲜二甲基亚砜（DMSO）重悬，于室温下在水浴超声仪中振荡10分钟。
   5. 加入190 µL 50 mM 三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）缓冲液（pH 7.4），轻轻吹打混匀。
   6. 在 4 °C 条件下以 20,817 × g 离心 20 分钟，去除蛋白质聚集体。
   7. 4 °C 下孵育上清液过夜，次日于 4 °C 以 20,817 x g 离心 20 分钟，弃去可能存在的蛋白质聚集体。
   8. 使用二辛可宁酸（BCA）法测定Aβ42浓度。将纯化的牛血清白蛋白（BSA）从1 mg/mL连续倍比稀释至0.0625 mg/mL，制备蛋白标准品，每种标准品取10 µL，设三个复孔加入多孔板中。将Aβ样品按1:4稀释后，取10 µL加入多孔板中，设三个复孔。混合BCA溶液A与溶液B，每孔加入200 µL。于37 °C孵育30分钟，在酶标仪上以....

结果

在 体外 凝固（浊度）实验，酶凝血酶切割纤维蛋白原，导致纤维蛋白网络的形成²⁴. 这种纤维蛋白凝块的形成会导致透过溶液的光线发生散射，从而引起浊度升高（图1），在阅读期结束前趋于平稳图2，绿色）。当纤维蛋白原在 Aβ42 存在下孵育时，溶液的浊度降低，其曲线最大高度约为仅含纤维蛋白原时的一半图 2A，蓝色）。在最近的一项研究中，合成了一系列Aβ聚集抑制剂，并评估了它们抑制Aβ与纤维蛋白原相互作用的能力，鉴定出化合物TDI-2760¹⁴我们已在研究中使用TDI-2760来阻断Aβ与纤维蛋白原的相互作用。如先前报道，在TDI-2760存在的情况下，Aβ的作用得到缓解，表现为浊度高于仅含Aβ的条件图 2A，红色）。TDI-2760.......

讨论

本文所述方法可提供一种可重复且快速的纤维蛋白凝块形成评估手段 体外此外，该系统的简便性使得解读Aβ如何影响纤维蛋白凝块的形成和结构变得相对直接。在本实验室此前的发表文章中，已证明这些检测方法可用于测试化合物抑制Aβ-纤维蛋白原相互作用的能力。^13,14利用这两种检测方法，对一系列合成化合物抑制 Aβ-纤维蛋白原相互作用的能力进行了分析。实际上，凝块浊度检测可用于筛选出具有治疗潜力的化合物，因为并非所有能够抑制 Aβ-纤维蛋白原相互作用的化合物都能恢复纤维蛋白凝块的形成。

浊度检测方法存在一些可能需要排查的问题或限制其应用的方面。主要限制在于不同实验之间可能存在某些变异，从而增加结果解释的难度。其中部分变异可能源于凝血酶活性。为排查凝血酶活性问题，使用者可在开始进行Aβ和测试化合物的实验之前，预先检测多种浓度凝血酶的凝块形成活性。在本实验条件下，若无纤维蛋白原存在，Aβ不会使溶液浊度高于背景水平，表明所观察到的浊度曲线是由纤维蛋白聚合所致。然而，Aβ.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
纤维蛋白原，血浆素原耗竭型血浆	EMD Millipore	341578	保持瓶盖用Parafilm密封，避免接触湿气
β-淀粉样蛋白（1-42），人源	Anaspec	AS-20276
人血浆凝血酶	Sigma-Aldrich	T7009
1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇，纯度大于等于99%	Sigma-Aldrich	105228
二甲基亚砜（DMSO），无菌过滤	Sigma-Aldrich	D2438
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Scientific	23225
Tris碱	Fischer Scientific	BP152
HEPES	Fischer Scientific	BP310
NaCl	Fischer Scientific	S271
CaCl2	Fischer Scientific	C70
滤膜注射器，0.2µm，25 mm	Pall	4612
Millex无菌注射式滤器，0.1 µm，PVDF，直径33 mm	Millipore	SLVV033RS
高结合力96孔板，平底，经认证	Fischer Scientific	21377203
Spectramax Plus384	Molecular Devices	89212-396
离心机，5417R	Eppendorf	5417R
Branson 200超声波清洗仪	Fischer Scientific	15-337-22
实验室旋转仪	Thermo Scientific	2314-1CEQ
盖玻片支架备用垫圈	Tousimis	8766-01
窄颈移液管 - Sedi-Pet	电子显微镜科学公司（EMS）	70967-13
临界点干燥仪样品支架（盖玻片支架）	Tousimis	8766
针式样品台支架盒	电子显微镜科学公司（EMS）	76610
圆形玻璃盖玻片（12 mm）	Hampton Research	HR3-277
10% 戊二醛	电子显微镜科学公司（EMS）	16120
乙醇	Decon Labs	11652
24孔板	Falcon	3047
Na Cacodylate	电子显微镜科学公司（EMS）	11652
SEM样品台，锥形末端针	电子显微镜科学公司（EMS）	75192
PELCO导电碳胶片，外径12 mm	Ted Pella	16084-1
Autosamdri-815 临界点干燥仪	Tousimis
Denton Desk IV 镀膜仪，配备金/钯靶材	Denton Vacuum
Leo 1550 FE-SEM	Carl Zeiss
Smart SEM 软件	Carl Zeiss