Le protocole décrit ici permet aux chercheurs de modifier précisément capsides adénovirus dans certains sites de chimie simple. Particules de vecteurs adénovirus blindé et vecteurs de transfert de gène reciblées peuvent être générés et interactions hôte vecteur peuvent être étudiées.
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Article de méthode
Combinée de Modifications chimiques et génétiques de la capside des vecteurs de transfert de gènes axée sur les adénovirus pour le blindage et le ciblage
Dans cet article
Résumé
Résumé
Vecteurs adénovirus sont des outils puissants pour virothérapie génétique de vaccination et oncolytiques. Cependant, ils sont sujettes à des interactions hôte-vecteur indésirables multiples, surtout après la livraison de in vivo . C’est un consensus que les limites imposées par l’interaction hôte-vecteur non désirés ne peuvent être surmontés si les modifications définies de la surface de vecteur sont effectuées. Ces modifications incluent le blindage des particules à partir des interactions non désirées et le ciblage de l’introduction de nouveaux ligands. Le protocole présenté ici vise à permettre au lecteur de générer blindé et, si vous le souhaitez, reciblé vecteurs de transfert de gène humain adénovirus ou virus oncolytiques. Le protocole permettra aux chercheurs de modifier la surface des capsides vecteurs adénovirus par un lien chimique spécifique des polymères synthétiques, glucides, lipides ou autres moitiés biologiques ou chimiques. Il décrit la technologie de pointe des modifications combinées capside génétiques et chimiques, qui auraient dû être divulgués afin de faciliter la compréhension et le franchissement des barrières pour en vivo livraison des vecteurs adénovirus. Une description détaillée et commentée des étapes cruciales pour la réalisation de réactions chimiques spécifiques avec biologiquement actives virus ou virus dérivés des vecteurs est fournie. La technologie décrite dans le protocole est basée sur l’introduction de génétique de la cystéine (naturellement absent) résidus en boucles exposés au solvant de vecteurs adénovirus-dérivé. Ces résidus de cystéine fournissent une réactivité chimique spécifique, après la production de vecteurs à des titres élevés, exploitables pour le très spécifique et efficace de couplage covalent chimique des molécules d’une grande variété de classes de substance au vecteur particules. Ce qui est important, ce protocole peut s’adapter facilement pour effectuer une large variété de modifications chimiques (non thiol dotés) différentes, des capsides vecteurs adénovirus. Enfin, il est probable que vecteurs de transfert de gène de base de virus non enveloppés, autres que les adénovirus peuvent être modifiées de la base du présent protocole.
Introduction
Adénovirus (Ad), membres de la famille des Adenoviridae, sont des virus à ADN non enveloppés de laquelle plus de 70 types jusqu'à présent ont été identifiés (http://hadvwg.gmu.edu). Selon les propriétés hemaglutination, structure du génome et résultats du séquençage, les types de 70 après JC se divisent en sept espèces (adénovirus humain A à G)1,2. Le génome humain des Ad est taille 38 Ko et encapsulé par une nucléocapside icosaédrique3. En raison de leur abondance, la capside protéine hexon, base de penton et fibre sont tous appelés protéines de capside majeure. La capside protéine hex....
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Protocole
Remarque : dans ce qui suit, un protocole pour PEGylation geneti-chimique d’une annonce vectorielle est décrite en détail. Pour activer le couplage spécifique de la portion de PEG, un vecteur Ad5 a été préalablement génétiquement modifié en introduisant un résidu cystéine dans la protéine hexon au hypervariables boucle 5 tel que décrit dans une précédente publication36et une cheville maléimide activé composé est utilisé comme composé de couplage.
1. préparation des tampons pour la Purification de vecteurs par gradient de CsCL étape
- Préparer 400 mL de tampon d’adénovirus (Ad-tampon) en ajoutant 50 mM HEPES (....
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Résultats
Figure 2 montre des exemples de l’effet cytopathogène (ECP) sur les 293 cellules (HEK 293) qui indique la production réussie de vecteur. Cellules devraient montrer la morphologie (Figure 2) 40 à 48 heures après l’inoculation avec le vecteur de virus. La droite validant pour la récolte est crucial pour ne pas perdre des particules virales par lyse cellulaire et empêche l’oxydation des groupes thiol génétiquement introduites. Si le.......
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Discussion
L’efficacité par lequel les cystéines génétiquement introduits peuvent être chimiquement modifiés est typiquement 80 à 99 %, et certaines variables influent sur ce rendement. Tout d’abord, il est primordial que les cystéines génétiquement introduites ne subissent pas d’oxydation prématurée. Tout en étant bien protégé dans l’environnement réducteur des cellules producteur, il est obligatoire de fournir un environnement sans oxydation après la sortie de vecteur de particules provenant des cellules de producteur et au cours.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Purification vectorielle et modification chimique | |||
| Gaz argon Gaz | Air liquide | distributeur | |
| Azote liquide | Distributeur | Air liquide | |
| 500 mL tubes à centrifuger | Corning | 431123 | |
| Stericup Express Plus 0.22 µ ; m | Millipore | SCGPU02RE | |
| Tris(2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-10g | |
| 2 mL (3mL) Norm Ject (seringues) | Henke Sass Wolf | 4020.000V0 | |
| Fine-Ject aiguilles à usage unique (jaune 0,9 x 40 mm) | Henke Sass Wolf | 4710009040 | |
| Chlorure de césium 99,999 % Ultra Qualité | Roth | 8627.1 | |
| Perles de gel de silice | Applichem | A4569.2500 | |
| Méthoxypolyéthylène glycol maléimide - 750 (PEG mal-750) | Iris Biotech | magasin en billes de gel de silice à -80 ° ; C | |
| 13,2 mL Tubes ultracentrifuges ultra-transparents | Beckman Coulter | 344059 | uniquement ouvert dans le capot |
| Colonne de chromatographie d’exclusion de taille-10 | GE Healthcare | 17-0851-01 | stocker à 4 ° ; C |
| Hepes | AppliChem | A1069.1000 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem | A1112,0500 | |
| Glycérol | AppliChem | A1123.1000 | |
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | >Comments |
| Matériel pour la culture cellulaire | |||
| DPBS | PAN Biotech | P04-36500 | |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | |
| Trypsine/EDTA | PAN Biotech | P10-0231SP | |
| FBS Good | PAN Biotech | P40-37500 | |
| Pénicilline/Streptomycine | PAN Biotech | P06-07100 | |
| Embouts filtrants Biosphere (différentes tailles) | Sarstedt | ||
| (différentes tailles) | Sarstedt | ||
| (différentes tailles) | Plaques Sarstedt | ||
| TC 15cm | Sarstedt | 83.3903 | |
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Comments |
| Matériau pour protocole de coloration à l’argent | |||
| Methanol | J.T.Baker | 8045 | |
| Ethanol absolu | AppliChem | 1613,2500PE | |
| Acide acétique | AppliChem | A0820,2500PE | |
| Formaldéhyde 37 % | AppliChem | A0877,0250 | |
| Éthanol absolu | AppliChem | A1613,2500PE | |
| Thiosulfate de sodium | AppliChem | 1,418,791,210 | |
| Nitrate d’argent | AppliChem | A3944.0025 | |
| Carbonate de sodium | AppliChem | A3900,0500 | |
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Comments |
| >Special Lab Equipment | |||
| Desiccator | Nalgene | 5311-0250 | |
| Megafuge 40 | Heraeus | ||
| Roter pour Megafuge TX750 + Adaptateur et couvercles pour tubes de 500 mL | Heraeus | ||
| Bain-marie | Ultracentrifugeuse conventionnelle | ||
| par exemple Optima XPN-80 | Beckman Coulter | ||
| Rotor Ultrazentrifuge adapté par ex. SW41 | Beckman Coulter | ||
| PH-mètre | Conventionnel | ||
| Support avec pinces | Conventionnel | ||
| Lampe à col de cygne | Conventionnel Conventionnel | ||
| Rotor suspendu | Conventionnel | ||
| Bloc thermique | Conventionnel | ||
| Photomètre (OD 260) | Conventionnel |
Références
- Benko, M., Harrach, B. Molecular evolution of adenoviruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. , 3-35 (2003).
- Davison, A. J., Benko, M., Harrach, B. Genetic content and evolution of adenoviruses. Journal of Genetic Virology. 84, 2895-2908 (2003).
- Rowe, W. P., Huebner, R. J., Gilmore, L. K., Parrott, R. H., Ward, T. G.
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Réimpressions et autorisations
