ここで説明したプロトコル具体的に単純な化学によって選定されたサイトでアデノ ウイルスのカプシドを変更することも可能。 にします。シールド アデノ ウイルス粒子のベクトルし、ターゲット遺伝子の転送ベクトルを生成することができます、ベクトル ホストの相互作用を学ぶことができます。
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この記事について
サマリー
要約
アデノウイルスベクターは、遺伝的のワクチン接種と腫瘍溶解性 virotherapy の強力なツールです。しかし、彼らは体内納入後特に複数の好ましくないベクトル ホスト相互作用しやすいです。ベクトル表面の定義の変更が実行される場合、望ましくないベクトル ホスト相互作用によって課された制限できるだけコンセンサスを克服します。これらの変更には、不要なやりとりから粒子のシールドと、新しい配位子の導入によってターゲットが含まれます。ここで提示されたプロトコルの目標を生成するリーダーを有効にするのにはシールドし、必要な場合に再ターゲット ヒト アデノ ウイルス遺伝子の転送ベクトルまたは腫瘍溶解性ウイルス。プロトコルは、研究者が合成ポリマー、炭水化物、脂質、または他の生物学的または化学鎖の特定の化学吸着によるアデノ ウイルス ベクター カプシドの表面を変更する有効になります。アデノウイルスベクターの生体内での配信のための障壁の克服と理解を容易にするために示されている結合された遺伝物質と化学キャプシドの変更の最先端の技術を説明します。生物学的活性のウイルスやウイルス由来のベクトルで特定の化学反応を実行するための重要なステップの詳細とコメントの説明が提供されます。プロトコルに記載されている技術 (当然欠席) システインの遺伝子の導入に基づいているアデノ ウィルス由来のベクターの溶媒露出ループに残留。これらのシステイン残基が高価にベクトルの生産後、ベクトルにさまざまな物質のクラスから分子の共有結合化学結合を特定性の効率的な悪用されることができます、特定の化学反応性を提供します。粒子。重要なは、このプロトコルは、さまざまな異なるアデノ ウイルス ベクター カプシドの (非チオール ベースの) の化学修飾を行う簡単に適合できます。最後に、それは可能性が高いそのエンベロープを持たないウイルス遺伝子の転送ベクトル以外、アデノ ウイルスは、このプロトコルの基本から変更できます。
概要
アデノ ウイルス (Ad)、アデノ ウイルス、家族のメンバーは、エンベロープを持たない DNA ウイルスの 70 以上の種類の識別 (http://hadvwg.gmu.edu) がこれまでされています。Hemaglutination プロパティ、ゲノム構造および結果を配列する、に応じて 70年広告の種類は 7 種 (人間のアデノ ウィルス A g)1,2に分割できます。ヒトゲノム広告サイズ 38 kb し、正二十面体のヌクレオキャプシド3によってカプセル化されました。その豊富なのためのキャプシド蛋白質ヘクソン、ペントン ベース、および繊維すべてと呼ばれます主要キャプシド蛋白質。最も豊かで、最も大きいキャプシド蛋白質ヘクソンを形作る 20 キャプシドの面があり、それぞれ 12 ヘクソン homotrimers4,5で構成されます。ペントン、正二十面体の辺 (頂点) があるはペントン ベースのポリアクリルアミドゲルから成り、糖繊維スチレンダイマー5,6の組み込まれている頂点スパイク ベースを表します。ネイティブの広告のセルの入力は基本的に....
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プロトコル
注: 以下では、ベクトルは詳細に記載されている広告の geneti 化学を peg 修飾操作するためのプロトコル。ペグ部分の特定の結合を有効にするには、Ad5 ベクトルはあらかじめ遺伝子以前の文書36およびマレイミド活性化 PEG の説明に従って可変ループ 5 でヘクソン タンパク質システイン残基を導入した変更化合物は、化合物のカップリングとして使用されます。
1. CsCL ステップ グラデーション ベクター精製バッファーの準備
- 50 mM HEPES (4.76 g/400 mL) を追加することで 400 mL のアデノ ウイルス バッファー (広告-バッファー) の準備と 150 mM NaCl 3.504 g (400 mL) 二重蒸留水 (ddH2O)。このバッファーの 350 mL に必要な次の 3 つの広告-バッファー バリエーションを準備します。
- バリエーション a: 広告-バッファーの 150 mL の NaOH で ph 7.6 を調整します。
- バリアント b: は 50 mL に最終濃度 10 mM TCEP [tris(2-carboxyethyl)phosphine), 0.143 g] を追加し、塩酸で pH 7.2 にそれを調整します。
- バリアントの c: は、150 mL に 0.5 mM TC....
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結果
図 2は、成功ベクトル生産を示します 293 の (HEK 293) 細胞の細胞変性効果 (CPE) の例を示します。セル型ウイルスベクター接種後 40 〜 48 時間形態 (図 2) が表示されます。収穫のための右の timepoint は、セル換散によってウイルス粒子を失っていないと遺伝子導入のチオール基の酸化を防止するため重要です。ベクトル粒子は、セル換散によって媒体に公開された場合、導入したチオール、すぐに酸化と浄化し、化学的に変更することは困難となります。
図 3は、模範的な CsCl バンドを示しています。化学修飾は、ウイルスの粒子から細胞の残骸を削除する前に、不連続 CsCl バンディングの目的。その後、改変自体は CsCl で起こることができます。化学修飾の後.......
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ディスカッション
効率で遺伝子導入されたシステインを化学的に変更できますが通常 80-99% と、この効率に影響を与える特定の変数。まず、それは遺伝子導入のシステインに早期酸化が行われていないことが重要です。プロデューサー細胞の還元環境で、セキュリティで保護しながら、ベクトル粒子化学修飾の間に、プロデューサー細胞を解放した後非酸化的環境を提供するためには必須です。このため、濃度 0.1 〜 10 ミリメートルで使用できる還元剤、チオール グループは、マレイミド活性化合物と容易に反応するだろうかを含まない還元試薬を使用する必要があります。第二に、マレイミド活性化合物を使用する場合カップリング反応中に pH を超えない 7.35、pH 7.4 は、反応の特異性を減らすことができるより大きいの以来。第三に、いずれの場合も、アミン無料バッファー (例えばHEPES、PBS) は、反応に使用する必要があります。注記のうち、システイン軸受ベクトル粒子はダブル CsCl として記述されていた、[HEPES/10% グリセロール化学変更前のストアド バンディングによって精製できます。この場合、0.1-1 mM TCEP がする必要があります使用される還.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ベクター精製と化学修飾 | |||
| アルゴンガス | エアリキード | ローカルガスディーラー | |
| 液体窒素エアリ | キード | ローカルガスディーラー | |
| 500 mL遠心分離チューブ | コーニング | 431123 | |
| ステリカップエクスプレスプラス0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-10g | |
| 2 mL (3mL) Norm Ject (syringes) | Henke Sass Wolf | 4020.000V0 | |
| Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm) | Henke Sass Wolf | 4710009040 | |
| Caesium chloride 99.999% Ultra Quality | Roth | 8627.1 | |
| シリカゲルビーズ | Applichem | A4569.2500 | |
| メトキシポリエチレングリコールマレイミド - 750 (PEG mal-750) | アイリス | ストア -80 >C | |
| 13.2 mL 超透明超遠心チューブ | ベックマン・コールター | 344059 | フード |
| PD-10 サイズ排除クロマトグラフィーカラム | GE Healthcare | 17-0851-01 | で 4 °C のみのオープン。C |
| Hepes | AppliChem | A1069.1000 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem | A1112,0500 | |
| グリセロール | AppliChem | A1123.1000 | |
| Name | Company | カタログ番号 | Comments |
| >細胞培養用材料 | |||
| DPBS | PAN Biotech | P04-36500 | |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | |
| トリプシン/EDTA | PAN Biotech | P10-0231SP | |
| FBS Good | PAN Biotech | P40-37500 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | PAN Biotech | P06-07100 | |
| バイオスフィアフィルターチップ(各種サイズ) | ザルスタット | ||
| 血清ピペット(各種サイズ) | ザルスタット | ||
| 反応チューブ(各種サイズ) | ザルスタット | ||
| TCプレート 15cm ザルスタットTCプレート 15cm | ザルスタット | 83.3903 | |
| 名前 | 会社名 | カタログ番号 | >コメント |
| 材料 銀染色プロトコル | |||
| Methanol | J.T.Baker | 8045 | |
| エタノール絶対 | AppliChem | 1613,2500PE | |
| 酢酸 | AppliChem | A0820,2500PE | |
| ホルムアルデヒド 37% | AppliChem | A0877、0250 | |
| エタノール絶対 | AppliChem | A1613,2500PE | |
| オ硫酸ナトリウム | AppliChem | 1,418,791,210 | |
| 硝酸銀 | AppliChem | A3944.0025 | |
| 炭酸ナトリウム | AppliChem | A3900,0500 | |
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| Special Lab Equipment | |||
| デシケーター | Nalgene | 5311-0250 | |
| Megafuge 40 | Heraeus | ||
| Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes | ヘレウス | ||
| ウォーターバス | 従来の | ||
| 超遠心分離機例:Optima XPN-80 | ベックマン・コールター | ||
| 適切な超zentrifuge ローター例:><ベ | ックマン・コールター | ||
| pH メーター | 従来型 | ||
| スタンド | 従来型 | ||
| グースネックランプ | 従来型 | ||
| オーバーヘッドローター | Conventional | ||
| Thermal Block | Conventional Photometer | ||
| (OD 260) | Conventional |
参考文献
- Benko, M., Harrach, B. Molecular evolution of adenoviruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. , 3-35 (2003).
- Davison, A. J., Benko, M., Harrach, B. Genetic content and evolution of adenoviruses. Journal of Genetic Virology. 84, 2895-2908 (2003).
- Rowe, W. P., Huebner, R. J., Gilmore, L. K., Parrott, R. H., Ward, T. G.
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再版と許可
