Nya metoder för Intranasal administrering Under inandning narkos att utvärdera näsa-till-hjärnan Drug Delivery
Summary
Här beskriver vi två nya metoder för stabil intranasal administrering under inandning anestesi med minimal fysisk stress av försöksdjur. Vi beskriver också en metod för kvantitativ utvärdering av narkotika distribution nivåer i hjärnan via näsan-till-hjärnan vägen med hjälp av radioaktivt märkt [14C]-inulinsirap som modell substrat av vattenlösliga makromolekyler.
Abstract
Intranasal administrering har rapporterats vara en potentiell väg för näsa-till-hjärnan leverans av terapeutiska medel som kringgår den blod – hjärnbarriären. Dock har förekommit några rapporter om inte bara den kvantitativa analysen men också optimal administration villkor och doseringsregimer för undersökningar av näsa-till-hjärnan leverans. Den begränsade framstegen i forskning på näsan-till-hjärnan väg mekanismer använder gnagare utgör ett betydande hinder när det gäller utforma näsa-till-hjärnan leveranssystem för läkemedelskandidater.
För att få vissa framsteg i detta avseende har vi utvecklat och utvärderat två nya metoder för stabil intranasal administrering under inandning anestesi för försöksdjur. Vi beskriver också en metod för utvärdering av narkotika distribution nivåer i hjärnan via näsan-till-hjärnan vägen med hjälp av radioaktivt märkt [14C]-inulin (molekylvikt: 5.000) som modell substrat av vattenlösliga makromolekyler.
Inledningsvis utvecklat vi en pipett-baserade intranasal administrering protokoll använder tillfälligt öppningsbar masker, som gjorde det möjligt för oss att utföra pålitliga administration till djur under stabil anestesi. Med detta system, [14C]-inulinsirap kunde levereras till hjärnan med lite experimentella fel.
Därefter utvecklade vi en intranasal administrering protokollet medför omvänd kanylering från luftvägarna sida genom matstrupen, som utvecklades för att minimera effekterna av mukociliär clearance (MC). Denna teknik ledde till betydligt högre nivåer av [14C]-inulinsirap, som upptäcktes kvantitativt i luktbulben, storhjärnan och förlängda märgen, än metoden pipett. Detta verkar vara eftersom lagring av drogen lösningen i näshålan ökades väsentligen genom aktiv förvaltning med en sprutpump i en riktning motsatt MC in i näshålan.
Sammanfattningsvis kan de två metoderna för intranasal administrering utvecklats i denna studie förväntas vara extremt användbara tekniker för att utvärdera farmakokinetiken hos gnagare. Metoden omvänd kanylering, i synnerhet, kan vara användbara för att utvärdera den fulla potentialen av näsa-till-hjärnan leverans av läkemedelskandidater.
Introduction
Bioläkemedel som peptider, oligonukleotider och antikroppar anses ha potentiella ansökan som romanen terapeutiska medel för eldfasta centrala nervsystemet som har för närvarande ingen botande behandling. Men eftersom de flesta bioläkemedel är vattenlösliga makromolekyler, är leverans från blodet in i hjärnan via intravenös oral administrering extremt svårt på grund av impedansen hos den blood – brain barriären (BBB).
Under de senaste åren har intranasal administrering rapporterats vara en potentiell väg för näsa-till-hjärnan leverans av terapeutiska medel som undviker BBB1,2,3,4,5. Dock har det varit relativt få rapporter om kvantitativ analys av näsa-till-hjärnan väg leverans6. Dessutom har praktiskt taget inga rapporter på etablerade optimal administration villkor och doseringsregimer, såsom volym, gånger, tidsperioder och hastighet, för utredningar av näsa-till-hjärnan leverans. De ovannämnda bristerna kan hänföras till följande orsaker: (i) en optimal metod för intranasal administrering för möss har ännu fastställas, och (ii) intranasal administrering av pipettering, som används allmänt, kännetecknas vanligtvis av interindividuell variation bland djur på grund av mukociliär clearance (MC), vilket ofta leder till underestimations av en viss drog faktisk näsa-till-hjärnan leverans potential.
Inandning anestesi med isofluran (initiering: 4%, underhåll: 2%) med en inandning mask för gnagare har vunnit utbredd användning, med syftet att minska eller eliminera smärta i samband med kirurgi utförs på försöksdjur. Användning av masker gör det relativt enkelt att utföra typisk Läkemedelslära i försöksdjur under inandning narkos via subkutan, intraperitoneal och intravenös rutterna. Masken måste dock vid intranasal administrering, tas tillfälligt bort från djuren för Läkemedelsverket. Med underhåll under 2% isofluran, djur normalt vakna upp snabbt från inandning anestesi. När administrationen volym per dos är stor, detta kan orsaka drog lösningen att flöda från näshålan i matstrupen, och en stor dos kan därför behöva delas upp i flera mindre doser för intranasal administrering till små djur. Som intranasal administrering kräver mask borttagning för upprepad administrering och tillräckligt med tid för ihållande näshålan leverans, finns det en hög sannolikhet att möss skulle vakna upp ur narkos under förfarandet för administration. Detta gör det mycket svårt att utföra intranasal administrering under ett stabilt bedövningsmedel tillstånd, och bidrar förmodligen till den observerade interindividuella variationen av näsa-till-hjärnan leverans bland gnagare.
I denna studie har vi därför utvecklat två nya metoder för stabil intranasal administrering under inandning anestesi, som medför minimal fysisk stress på försöksdjuren. I den första metoden används en tillfälligt öppningsbar mask som gör intranasal administrering under inandning anestesi. Den öppningsbara delen av masken innehåller en silikon-kontakt som kan användas i enlighet med administration timing för att underlätta stabil intranasal administrering med pipett. För den andra metoden, en kanyl var opereras in för att passera från matstrupen till näshålan och en sprutpump fästes sedan till detta så att drogen lösningen kunde levereras direkt och tillförlitligt i näshålan under stabila inandning anestesi. Denna metod kan förbättra leverans av läkemedel till hjärnan via näsan-till-hjärnan rutten, eftersom genom att väsentligt minimera effekterna av MC, drog retentively i näshålan skulle förbättras. Dessutom beskriver vi en metod för att utvärdera kvantitativt narkotika distribution nivåer (% för hjärnans injicerad dos/g) i hjärnan med hjälp av radioaktivt märkt [14C]-inulinsirap [molekylvikt (MW): 5.000] som en modell substrat av vattenlösliga makromolekyler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Näsa-till-hjärnan leverans av läkemedel förväntas ha en uttalad effekt på centrala nervsystemet eftersom detta utbildningsavsnitt utgör en direkt transportled som kringgår BBB. Tre olika näsa-till-hjärnan vägar har rapporterats till datum8. Först är luktnerven vägen, som passerar från lukt slemhinnan i nässlemhinnan till framhjärnan via luktnerven. Andra är den trigeminusnerven vägen, som passerar från respiratoriska slemhinnan i nässlemhinnan till hjärnstammen i hindbrain vi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes delvis av privata universitet Branding forskningsprojektet från MEXT; ett bidrag för vetenskapliga Research (C) (17 K 08249 [att T.K. och T.S.]) från Japan sällskapet för främjande av vetenskap (JSPS); bidrag för forskningssamverkan från stiftelsen Hamaguchi för befordran av biokemi [till T.S.], och Takeda Science Foundation [att T.K.]. Vi tackar Mr Yuya Nito och Ms. Akiko Asami för deras värdefulla tekniska hjälp bedriva experimenten.
Materials
| ddY mouse | Japan SLC, Inc. | Male, 4-6 weeks, 20-30 g | |
| Isoflurane | Pfizer | v002139 | |
| Isoflurane setup | SHINANO manufacturing CO. LTD. | SN-487-OTAir, SN-489-4 | |
| Isoflurane mask | SHINANO manufacturing CO. LTD. | For small rodents | |
| Isoflurane mask (Opneable type) | SHINANO manufacturing CO. LTD. | Special orders | |
| Anesthesia Box | SHINANO manufacturing CO. LTD. | SN-487-85-02 | |
| Animal experiments scissors-1 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | B-27H | |
| Animal experiments scissors-2 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | B-13H | |
| Tweezers-1 | FINE SCIENCE TOOLS Inc. | 11272-30 | Dumont #7 Dumoxel |
| Tweezers-2 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | A-12-1 | |
| Cannula tube (PE-50) | Becton, Dickinson and Company. | 5069773 | I.D.: 0.58 mm, O.D.: 0.965 mm |
| Cannula tube (SP-10) | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | KN-392 | I.D.: 0.28 mm, O.D.: 0.61 mm |
| Shaver | MARUKAN, LTD. | DC-381 | |
| Stereoscopic microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
| Needle 27G 1/2 in 13 mm | TERUMO CORPORATION | NN-2738R | |
| 1 mL syringe | TERUMO CORPORATION | SS-01T | |
| Syringe pump | Neuro science | NE-1000 | |
| Cellulose membrane | Toyo Roshi Kaisya, Ltd. | 00011090 | |
| Micro spatula | Shimizu Akira Inc. | 91-0088 | |
| Micropipette (0.5-10 uL) | Eppendorf AG | Z368083 | |
| Pipette chip | Eppendorf AG | 0030 000.811 | |
| Tape | TimeMed Labeling System, Inc. | T-534-R | For fixing mouse |
| [14C]-Inulin | American Radiolabeled Chemicals Inc. | ARC0124A | 0.1 mCi/mL |
| EtOH | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 054-00461 | |
| Liquid scintillation counter | Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc | Tri-Carb 4810TR |
References
- Sakane, T., Yamashita, S., Yata, N., Sezaki, H. Transnasal delivery of 5-fluorouracil to the brain in the rat. Journal of Drug Targeting. 7 (3), 233-240 (1999).
- Illum, L. Transport of drugs from the nasal cavity to the central nervous system. European Journal of Pharmaceutical Science. 11 (1), 1-18 (2000).
- Hanson, L. R., Frey, W. H. Intranasal delivery bypasses the blood-brain barrier to target therapeutic agents to the central nervous system and treat neurodegenerative disease. BMC Neuroscience. 9 (Suppl 3), S5 (2008).
- Chapman, C. D., et al. Intranasal treatment of central nervous system dysfunction in humans. Pharmaceutical Research. 30 (10), 2475-2484 (2012).
- Kanazawa, T. Development of non-invasive drug delivery system to the brain for brain diseases therapy. Yakugaku-Zasshi. 138 (4), 443-450 (2018).
- Kozlovskaya, L., Abou-Kaoud, M., Stepensky, D. Quantitative analysis of drug delivery to the brain via nasal route. Journal of Controlled Release. 189, 133-140 (2014).
- Hirai, S., Yashiki, T., Matsuzawa, T., Mima, H. Absorption of drugs from the nasal mucosa of rat. International Journal of Pharmaceutics. 7 (4), 317-325 (1981).
- Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Advances in Drug Delivery Reviews. 64 (7), 614-628 (2011).
- Lalatsa, A., Schatzlein, A. G., Stepensky, D. Strategies to deliver peptide drugs to the brain. Molecular Pharmaceutics. 11 (4), 1081-1093 (2014).
- Kanazawa, T. Brain delivery of small interfering ribonucleic acid and drugs through intranasal administration with nano-sized polymer micelles. Medical Devices. 8, 57-64 (2015).
- Kanazawa, T., et al. Enhancement of nose-to-brain delivery of hydrophilic macromolecules with stearate- or polyethylene glycol-modified arginine-rich peptide. International Journal of Pharmacology. 530 (1-2), 195-200 (2017).
- Kamei, N., et al. Effect of an enhanced nose-to-brain delivery of insulin on mild and progressive memory loss in the senescence-accelerated mouse. Molecular Pharmaceutics. 14 (3), 916-927 (2017).
- Suzuki, T., Oshimi, M., Tomono, K., Hanano, M., Watanabe, J. Investigation of transport mechanism of pentazocine across the blood-brain barrier using the in situ rat brain perfusion technique. Journal of Pharmaceutical Science. 91 (11), 2346-2353 (2002).
