We presenteren een protocol voor de real-time optische detectie van één labelloze eiwitten zoals ze worden uitgescheiden uit levende cellen. Dit is gebaseerd op de microscopie interferometrische verstrooiing (iSCAT), die kan worden toegepast op een verscheidenheid van verschillende biologische systemen en configuraties.
We tonen de interferometrische verstrooiing (iSCAT) microscopie, een methode voor het opsporen van één labelloze eiwitten uitgescheiden door individuele levende cellen in real time van. In dit protocol behandelen wij de fundamentele stappen voor het realiseren van een iSCAT-Microscoop en aanvullen met extra imaging kanalen om te controleren de levensvatbaarheid van een cel bestudeerde. Na dit gebruiken we de methode voor real-time detectie van enkele eiwitten zoals ze worden uitgescheiden van een levende cel waaruit we met een vereeuwigd B-cel-lijn (Laz388). Nodige maatregelen betreffende de voorbereiding van de Microscoop en monster alsook de analyse van de vastgelegde gegevens worden besproken. Het protocol van de video toont aan dat iSCAT microscopie biedt een eenvoudige methode om te studeren secretie op het niveau van de single-molecuul.
Secreted eiwitten spelen een belangrijke rol in verschillende fysiologische processen1. Hierdoor worden zij routinematig bestudeerd als een collectieve ensemble (proteomics) of als afzonderlijke entiteiten2,3. Proteomics onderzoekt traditioneel de hele set van eiwitten aanwezig zijn in een bepaald biologisch systeem door middel van bijvoorbeeld enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), stroom cytometry of massaspectrometrie4,5, 6. Aan de andere kant, zijn één eiwitten, over het algemeen gedetecteerd met behulp van een verscheidenheid van technieken die zijn gebaseerd op de fluorescentie7,8, plasmonics9,10, of cryogene elektron11 microscopies. Al deze technieken gebruik van complexe instrumenten, labelen, of beide en ontbreekt het vaak aan dynamiek informatie zoals zij alleen op lange termijn informatie over het systeem onder studie leveren.
Hier gebruiken we iSCAT12,13 microscopie aan gevoel individuele secretoire eiwitten met sub tweede temporele resolutie14. Nog belangrijker is, detecteert de techniek het zwakke verspreide signaal inherent is aan iedere eiwit12,14. De hoeveelheid licht die een kleine bioparticle verstrooit schalen met haar polarizability. Ervan uitgaande dat de vorm van een eiwit kan worden benaderd door een effectieve verstrooiing bol14,15,16, en dat verschillende eiwitten hebben zeer vergelijkbaar brekingsindices, de gemeten signaal rechtstreeks kan worden aangesloten op het molecuulgewicht (MW) van het eiwit. De empirische kalibratie van iSCAT contrast versus moleculair gewicht door referentiemetingen kan men onderscheiden van proteïnen van verschillende maten. iSCAT experimenten kunnen gemakkelijk worden aangevuld met fluorescentie microscopie17,18, immunosorbent reagentia, evenals TL of verstrooiing etiketten te maken voor een specifieke detectie van een proteïne van belang14 , 17 , 19.
In principe functioneert iSCAT door het sturen van een eiwit zwakke verstrooide licht via de interferometrische mengen met een secundaire verwijzing Golf. De gedetecteerde intensiteit () in een iSCAT Microscoop wordt beschreven door
waar is de incident intensiteit,
is een coëfficiënt voor de bijdrage van de referentie-Golf,
betekent de kracht van de verstrooiing van de nano-object onder studie, en
is de faseverschuiving tussen de verspreide en verwijst naar golven14. Ofwel het verzonden of gereflecteerd, rug incident licht wordt meestal gebruikt als een referentie-Golf, waar in elk geval
rekeningen voor de transmissivity of de reflectiviteit van de monsterkamer, respectievelijk. De term
is evenredig aan het eiwit van verstrooiing cross sectie en kan worden verwaarloosd t.o.v. de cross term. Aldus, de vaststelling van
voor volledige destructieve interferentie, het gedetecteerde licht wordt gegeven door
waar
is de intensiteit van de verwijzing en
is de intensiteit van de storing.
iSCAT microscopie biedt een uitstekende methode om te bestuderen van de biologische processen op het niveau van de single-molecuul. Als voorbeeld, onderzoeken we de Laz388 cellen — een Epstein – Barr virus (EBV) getransformeerd B-lymfocyt cel lijn20,21 — zoals ze eiwitten zoals IgG antilichamen16 afscheiden. Echter, de methode is algemeen en kan worden toegepast op een verscheidenheid van andere biologische systemen. iSCAT is inherent aspecifieke en eiwit kan detecteren of nanoparticle, of het kan worden uitgebreid met gemeenschappelijk oppervlak functionalization methoden voor de detectie van de specifieke of multiplexed. De eenvoud en de mogelijkheid om te worden gecombineerd met andere optische technieken, zoals fluorescentie microscopie, maken van iSCAT een waardevolle aanvullend instrument in de celbiologie.
Een van de meest cruciale aspecten voor het verkrijgen van nuttige iSCAT gegevens is de mogelijkheid om het vinden van de juiste focal positie op het dekglaasje aan oppervlak, en, bovendien, houd deze positie voor langere tijd. Niet te doen zal resulteren in de verruimde spinnen bestemde, zwakke iSCAT signalen en drift-geassocieerde artefacten in dynamics analyses. Het blijkt dat het brandvlak vinden op een dekglaasje schoon, kaal aan oppervlak niet een gemakkelijke taak is als oppervlaktekenmerken niet zichtbaar tegen de achtergrond van de lichtbundel grote referentie zijn (Zie Figuur 4 d).
Rauwe iSCAT beelden zijn vaak verduisterd door achtergrond signalen die voortvloeien uit de wavefront onzuiverheden in de bron excitatie en iemands vermogen om te vinden van de juiste beeldvorming vliegtuig kunnen belemmeren. Actieve wavefront aftrekken is een handige manier om dit probleem te omzeilen en vervolgens controleren de iSCAT focus tijdens een meting16. Een manier om dit te bereiken is via ruimtelijke monster modulatie. Kortom, geldt een functiegenerator een blokgolf 50 Hz voor de poort van de externe controle van de piëzo-fase, wat resulteert in een ruimtelijke monster modulatie op de toegepaste frequentie (290 nm amplitude). Synchrone camera overnames worden getriggerd uit dezelfde bron, en combinatie door lock-in principes, leiden tot een wavefront-gecompenseerd afbeelding14,16. De resulterende afbeelding toont meestal de oppervlakteruwheid van het dekglaasje aan (figuur 4e). Kleine elementen na reiniging kan worden gebruikt om de Microscoop in focus nog op het glas. Parameters die worden gebruikt voor deze actieve achtergrond aftrekken stap kunnen worden gewijzigd volgens de framesnelheid, belichtingstijd of hardware.
Zoals hierboven vermeld, het gebruik van een hoge kwaliteit balk splitter in het iSCAT-setup (stap 1.2.1.) wordt aanbevolen, als artefacten zoals beeldschaduwen imaging of interferentie als gevolg van dunne vlakke beam splitters zal beïnvloeden het beeld en de meting verstoren. Figure 7 toont een vergelijking tussen een hoge kwaliteit en lage kwaliteit balk splitter. Beide raw iSCAT beelden tonen hetzelfde gebied op het dekglaasje aan met sommige overblijvende deeltjes. De zelfde iSCAT setup werd gebruikt om beide beelden te vangen, alleen de balk splitter werd uitgewisseld. Figuur 7a toont het beeld gevormd op de camera door het gebruik van een dikkere (5 mm), AR-coating, en steken balk splitter. Wegens de steken opzet, de weerkaatste lichtbundel van het achterste oppervlak van de balk splitter is anti-parallel aan de reflectie die voortvloeien uit de voorzijde en is het niet invoeren van de doelstelling. Geen inmenging artefacten optreden. Figuur 7b toont het hetzelfde gezichtsveld op monster, maar ditmaal een dunner (1 mm) vlakke balk splitter is gebruikt. De twee reflecties van de oppervlakken van voor- en achterkant van de balk splitter zijn parallelle en doorgeven aan de camera. Interferentie artefacten zijn duidelijk zichtbaar.
Figuur 7: vergelijking van iSCAT beelden geproduceerd met behulp van hoge – en lage-kwaliteit beam splitters. (a) afbeelding van de rauwe iSCAT Resulting door gebruik van een 5 mm dikke AR-coating en steken balk splitter. (b) Resulting rauwe iSCAT afbeelding van hetzelfde gebied door gebruik van een 1 mm dikke vlakke balk splitter. Beide beam splitters hebben dezelfde verdelende verhouding (50% reflectie, 50% overdracht). Interferentie artefacten die voortvloeien uit de reflecties van de Fresnel duidelijk in acht worden genomen in de afbeelding dat is geproduceerd met de 1 mm dik vlakke balk splitter. Schaal bars: 2 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
In dit protocol beschrijven we een regeling van de verlichting van het breed-gebied voor iSCAT zoals het is snel, eenvoudig te realiseren en zorgt voor parallelle sensing over een groot gebied14. Een andere gemeenschappelijke benadering is het gebruik van akoestisch-optische leidschoepen (gedelegeerd) en het scannen van een confocal balk over de monster12,17. Deze aanpak voorkomt de noodzaak van kwalitatief hoogstaande wavefronts maar is meer experimenteel complex dan conventionele beeldvorming van het breed-gebied. Bovendien wordt de snelheid van de confocal verlichtingssterkte beperkt door die van gedelegeerd. Afhankelijk van de gewenste experimentele parameters, kunnen, beide regelingen confocal of breed-gebied verlichting in principe, worden gebruikt om detecteren één eiwitten afgescheiden van levende cellen.
Zoals besproken in het gehele protocol, is het noodzakelijk om te minimaliseren van de laterale mechanische schommelingen in de fase van het monster van de Microscoop. Zelfs nanometer afwijkingen in de positie van het monster kunnen leiden tot variaties in opeenvolgende camera frames en veroorzaken aanzienlijke omgevingsgeluid in de differentiële afbeelding. Daarom wordt aangeraden om een mechanisch stabiel Microscoop-fase en een gedempte optische tabel (stap 1.1.1.) te gebruiken en ter dekking van de installatie met optische gordijnen of panelen tijdens een experiment (stap 3.5.).
Een actieve focus stabilisatie regeling kan ook worden overwogen voor de lange termijn metingen. In deze aanpak, is een tweede laser in een totale interne reflectie (TIR) regeling opgenomen in de Microscoop en vervolgens beeld op een fotodiode Kwadrant. Wijzigingen in het systeem focus vertalen naar laterale verplaatsingen van de plek op de Kwadrant diode, die vervolgens kan worden gebruikt in een actieve terugkoppeling te controleren van de z-as van de piezo fase26TIR-laser. Langetermijneffecten van de verticale drift worden dus geëlimineerd.
Verschillende wijzigingen en uitbreidingen kunnen worden toegepast op de gepresenteerde techniek om specifieke experimentele behoeften. Commerciële Microscoop fase incubators zijn bijvoorbeeld beschikbaar die gemakkelijk in de Microscoop iSCAT voor langdurige beeldvorming van cellen kunnen worden opgenomen. Andere technieken kunnen ook worden uitgevoerd als aanvulling op iSCAT imaging, zoals confocal of TIR fluorescentie microscopies17. Aan te passen op het systeem onder studie, iSCAT secretie metingen kunnen worden verricht in een andere cel media zoals DMEM of DPBS, echter moet de pH-indicator fenol-rode worden vermeden aangezien het het experiment als gevolg van de absorptie van het laserlicht kan verstoren. Bovendien bevatten de supplementen zoals foetaal kalfsserum (FCS) of menselijke bloedplaatjes lysate (hPL) eiwitten die met de detectie van de iSCAT interfereren kunnen. Afhankelijk van de gewenste gevoeligheid van het experiment, dienen deze supplementen worden uitgesloten van de microscopie medium.
iSCAT afhankelijk van een analyt scatter licht kunnen — een eigenschap die inherent is aan alle eiwitten — en dus inherent niet-specifieke. Niettemin, is een zekere mate van specificiteit kan als iSCAT signalen schaal lineair met eiwit massa14,27,28. Dit zorgt voor de kalibratie van een systeem van de iSCAT met behulp van standaard EiwitSteekproeven, zoals bovien serumalbumine (BSA) en fibrinogeen14,27,28. In feite, zeer onlangs, jonge et al. 28 hebben uitgebreid over het werk van Piliarik & Sandoghdar14 en hebben aangetoond dat iSCAT kan worden gebruikt voor het bepalen van het molecuulgewicht van eiwitten zo klein als daar (53 kDa) met een massa resolutie van 19 kDa en een nauwkeurigheid van ongeveer 5 kDa. Verschillende conventionele benaderingen kunnen iSCAT verder aanvullen door middel van een extra niveau van specificiteit. Als een voorbeeld, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), en/of andere oppervlakte wijzigingen, eiwit bindende gebeurtenissen zodanig beperken dat alleen het doel eiwit gedetecteerde16 is.
In dit protocol beschreven we hoe iSCAT microscopie kan worden gebruikt voor het onderzoeken van cellulaire afscheidingen op het niveau van één eiwit met subsecond temporele resolutie16. De techniek is algemeen en op alle commerciële of huis-gebouwde Microscoop kan worden uitgevoerd. In tegenstelling tot één-molecuul fluorescentie benaderingen, de methode geen last van photobleaching of knipperen effecten, maar het nog steeds behaalt single-eiwit gevoeligheid. Deze eigenschappen maken iSCAT een krachtig instrument op het gebied van biosensing en microscopie. Toekomstige toepassingen zal zich richten op het ophelderen van complexe cellulaire interacties zoals immunologische reactie op een stimulus of cellulaire communicatie.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door het Max-Planck-Gesellschaft, een hoogleraarschap aan Alexander-von-Humboldt, en de Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC 1181). Wij danken Stefanie Schaffer in Universitätsklinikum Erlangen, voor het verstrekken van Laz388 cellen en voor nuttige discussies. Wij danken Simone Ihloff en Maksim Schwab op MPL voor technische ondersteuning.
Item/Device | |||
100x / 1.46 NA objective | Zeiss | 420792-9800-000 | alpha Plan Apochromat oil immersion |
20x / 0.4 NA objective | Leica | 566049 | N Plan |
Piezo Stage | PI | P-517k020 | 3-axis stage with 100x100x10µm range |
Diode laser (445 nm) | Lasertack | PD-01236 | |
Optics/Optomechanics | Thorlabs/Newport | – | lenses, mirrors, posts, mounts |
Pinhole | Thorlabs | P30H | |
LED light source | Thorlabs | MCWHL5 | |
Shortpass filter (580 nm) | Omega Optical | 580SP | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
Longpass filter (500 nm) | Thorlabs | FEL0500 | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
70R/30T beam splitter | Newport | 20Q20BS.1 | |
Economy beam splitter | Thorlabs | EBS1 | used for the comparison of fringe effects |
Wedged plate beam splitter | Thorlabs | BSW26 | used for the comparison of fringe effects |
Shortpass dichroic mirror (550 nm) | Edmund Optics | 66249 | |
8R/92T beam splitter | Thorlabs | BP108 | |
CMOS camera | Photonfocus | MV1-D1024E-160-CL | for iSCAT aquisition |
CMOS cameras | Mightex | SCE-B013-U | for bright field / fluorescence aquisition |
Longpass filter (600 nm) | Thorlabs | FELH0600 | |
Computer | Fujitsu Siemens | – | Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD |
Acquisition Software | LabVIEW | – | LabVIEW 2016 Suite |
Analysis Software | Matlab | – | Matlab 2014 Suite |
Plasma Cleaner | Diener | Diener pico | |
Incubator | Binder | Model CB | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Reagent/Material | |||
RPMI 1640 medium | Gibco | 11835063 | without phenol red |
HEPES Buffer Solution (1M) | Sigma Aldrich | 59205C | |
Cover slides | Marienfeld | 107052 | |
Glass bottom culture dishes | ibidi | 81158 | |
Fluorescent Microspheres | Invitrogen | F8821 | used for calibration |
Immersol immersion oil | Zeiss | 444960 | |
Propidium iodide stain | Invitrogen | R37108 | |
Small pipette tips | Eppendorf | 30075005 | |
Flexible pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Ethanol, 99.8% | Fisher Scientific | E/0650DF/15 | |
Sodium hydroxide, pellets | Sigma Aldrich | 221465 | for preparing 0.2M NaOH solution |