このプロトコルの目的は、高スループット方法でゼブラフィッシュ稚魚の腸を介して蛍光に分類された食物の通過時間を測定することです。
ゼブラフィッシュは、医薬品安全性試験代替モデル有機体として使用されます。ゼブラフィッシュの胃腸 (GI) は哺乳類の遺伝的、神経細胞、および薬理学的類似点です。新薬候補の臨床試験中に消化不耐症は一般的であり、人の健康に深刻な脅威をもたらす可能性があります。哺乳類モデルで臨床消化管毒性のためのテストは、テスト混合物の時間と労力の面で高価なことができます。ここで紹介した高スループット方法を使用 GI 安全性の問題を予測する可能性があります。このメソッドは哺乳類モデルと比較して、化合物の少量を使用している間テスト消化管輸送の複合効果の適切な評価のためことができます。このメソッドは、ゼブラフィッシュ稚魚で (7 日後に受精) 蛍光ラベルを含んでいる食糧が供給されます。授乳後それぞれの仔魚は 96 円錐底ウェル プレートのウェルに配置、テスト混合物 (水に溶ける) または車両と投薬します。腸の通過が発生して糞便が、井戸の底に蓄積、井戸の底からの蛍光を測定することによってこれが起こる率を監視、プレート分光光度計を使用して時間をかけて繰り返し。特定治療群の幼虫から蛍光が平均化され、これらの値をグラフ化標準誤差とともに各計測時間の時間をかけて食品の平均通過を表す曲線を降伏します。腸通過時間に及ぼす影響は、車両投与群の各治療群の曲線下面積を比較することで識別されます。このメソッドは、知られている臨床 GI 効果と薬物によるゼブラフィッシュ消化管通過時間の変更を検出1 日あたり GI 効果のための治療の数十を尋問する使用できます。より安全な化合物できますすぐに優先的に哺乳動物テスト、発見と渡して 3 r 推進を効率化します。
ゼブラフィッシュ (動脈分布) を使用してモデル脊椎動物の生物学および薬物の毒性および/または有効性の予測これらのフィールドの新しいアプリケーションは、毎年出現します。ゼブラフィッシュの哺乳類モデル上の利点には、多産、小さなサイズ、および器官形成を通じて透明性があります。ゼブラフィッシュを使用すると、臓器の機能、例えば心臓、眼、胃腸の (GI)1,2の化合物の影響を評価する、薬物候補急性毒性, 同様の予測します。ゼブラフィッシュの開発および生理学は多くの方法3の哺乳類のそれらに類似して 80% のヒトの疾患に関連付けられている遺伝子ゼブラフィッシュ相同物4。
ゼブラフィッシュの消化管と同様の生理学は、哺乳類の消化管が単純なアーキテクチャ5があります。ゼブラフィッシュがある胃前部腸電球は、食品庫として機能します。ゼブラフィッシュ腸における遺伝子発現哺乳類5の多くの類似点があります。哺乳類のようなゼブラフィッシュの腸神経系は消化管運動を制御、腸神経支配は他の脊椎動物6、7のミラーします。これらの類似性に基づいて、人間の腸の機能障害は、ゼブラフィッシュ、哺乳類モデル8から派生したメソッドを使用して研究されている.
新薬候補の臨床試験中に消化不耐症は一般的であり、人の健康に深刻な脅威をもたらす可能性があります。2005 年-2010 年中に大手製薬会社でのプログラムの見直しでは、臨床研究終了9の 9% の主な原因として消化管の安全性を明らかにしました。哺乳類モデルで臨床消化管毒性のためのテストは、化合物、及び労働時間の面で高価なことができます。GI トランジットのための予測の高スループット試金は、化合物の毒性試験、柔軟性を提供し、3 r インパクトを実現できます。このような分析を提供している手法が記載プロトコルによって表示されます。この高スループット試金は候補者の優先順位、GI での安全検査より大きい種の削減に貢献する医薬品開発の初期段階で採用できるでしょう。
ゼブラフィッシュ幼虫消化管通過時間には、ここで紹介を測定するため新規吸光光度法は、哺乳類消化管機能に、治療効果を予測できる効率的な分析です。アッセイは、低感度を持つ、肯定的な予測性、高毒性12に基づいて候補者治療の数を皮をむくために採用最初の層の試金で使用できるがあります。このメソッドを実行する方が簡単です、スループットの高い、蛍光顕微鏡よりもステップの処理以下の動物を使用します。
本手法の技術的な課題があります。蛍光食品を供給し、個々 の井戸にそれらを転送することに最初に挑戦した後は、個々 の幼虫をキャッチします。しかし、練習では、熟練した技術者は 15 分未満の 96 ウェル プレートを埋めることができます。プレートが誤って動揺与えられた時点で、読む前に井戸の底から未解決の糞便蓄積が減少に表示されます。これを振ることがなく、慎重にプレートを移動することによって回避できます。我々 の経験でプレート分光光度計電動引き出しを含む、通常の動きはアッセイを乱さなかった。プレート ヒーター装備リーダー (すなわちプレートがない測定間インキュベーターに返却する)、アッセイ近くラボベンチ障害の低いチャンスを最適化する可能性があるがこれは我々 の経験で必要ではなかった。
メソッドでの初期の試みは、アッセイの前に、の日に餌を含みませんでした。これらの ‘練習’ 授乳せず幼虫の低い数字は処理前に許可される時間の間に十分な蛍光食品を消費しました。それらの試みの治療群内変動が大きかったとより多くのデータが時間の経過とともに低/いいえ信号蓄積のため使用できませんでした。練習が給餌してもいくつかの幼虫は蛍光食品の十分な量を消費しない、それらの幼虫からデータを除くグループ内での変動を減少、治療の効果を識別する機能を高めます。幼虫の貢献の分析に有用なデータの十分な数 (すなわち24対12) サイズの大きなグループを開始できます。
蛍光顕微鏡の最終時点からマイクロ プレート データ反映車グループと比較してアトロピン群下の最終的な信号しかし食品輸送がアトロピン投与の幼虫 (図示せず)、24 h でほぼ完了したこと明らかにします。逆に、高い最終的なマイクロ プレート蛍光は、にもかかわらず、車両処理幼虫がどうやら最後の時間ポイントの前に、消化管を無効との輸送時間の短縮を治療と関連付けられました。幼虫蛍光食品の供給の治療へランダムな割り当てに基づく、仮定蛍光食品の相当消費平均では、試験治療グループ間で。糞便からの蛍光が幼虫の消化管で過ごした時間とともに低下する、これを考えるし、上記パターンに基づいて、または高速トランジットは何とか糞便に蛍光を追加します。実際の原因は不明と尋問されていない、アッセイはまだしかし測定してグループ間の通過時間を比較することが可能です。
低分子化合物から消化管毒性の検出でこのメソッドの雇用は、1 つのアプリケーションです。他の可能なアプリケーションは、病モデル (例えば、過敏性腸症候群) と新たな治療法発見のような病気またはプロ運動化合物を発見するために含まれます。さらに、トランスジェニック モデルと相まって、このメソッドされる可能性があります通常の消化管輸送だけでなく、通過障害、腸溶性ニューロンの欠乏を含む遺伝子の役割を調査します。ゼブラフィッシュ幼虫が近似した細胞培養のスケールに全体の生物プラットフォームを提供が複数の組織や無数のセル型、ゼブラフィッシュで一緒に機能しているので、システム生物学の質問尋ねたことができますこれを使用して応答モデル。
技術とその新しい応用の進歩によって、ゼブラフィッシュ毒性試験の実施の効率は向上していきます。運用方法やアッセイ ゼブラフィッシュ稚魚は、高いスループット13,14面で改善を続けています。ここで紹介する手法は、もっとインパクトの強いゼブラフィッシュの研究をすることができる改善の一例です。
The authors have nothing to disclose.
Carpetbones.com のサイモン Cassar 設計し、アニメ フィギュア GI 輸送アッセイの人生で手順を示すために使用を作成します。
Wild type zebrafish breeding pair | Various sources – for example ZIRC (Zebrafish International Resource Center) | ZL-1 | Adult wild type zebrafish of AB lineage |
1.7-liter Breeding Tank – Beach Style Design | Tecniplast | 1.7L SLOPED | Breeding tank |
Instant Ocean sea salt | Intant Ocean | SS15-10 | Dehydrated sea salt |
First Bites larval fish food | Hikari | 20095 | Powdered larval fish food |
Yellow-green (505/515) Fluospheres | Invitrogen | F8827 | Fluorescent label |
V-bottom 96-well polystyrene microplates | Thermo Fisher Scientific | 249570 | Multiwell microplate with V-shaped bottom in each well |
Atropine | Sigma Aldrich | A0132 | |
Amitriptyline | Sigma Aldrich | A8404 | |
Tegaserod | Sigma Aldrich | SML1504 | |
Metoclopramide | Sigma Aldrich | M0763 | |
Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
Spectramax M2e microplate reader | Molecular Devices | Spectramax M2e | A multi-well plate spectrophotometer capable of fluorescent excitation and emission detection. |
SoftMax Pro | Molecular Devices | SoftMax Pro | Software for spectrophotometer data acquisition |