ICP0 は、HSV-1 感染核-細胞質転流を受けます。このイベントの分子メカニズムは知られていません。ここで我々 は将来解明で ICP0 転座を定量的に解析の基盤 HSV-1 感染の ICP0 運動を定量化するためのツールとしての共焦点顕微鏡の使用をについて説明します。
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この記事について
サマリー
要約
単純ヘルペス ウイルス (HSV-1) の 1 の感染細胞内蛋白質 0 (ICP0) は、リング型 E3 ユビキチンリ ガーゼを含む即時初期タンパク質です。その後ウイルス遺伝子の活性化とホストの制限要因のプロテアソームの責任です。ICP0 には、標準的な核局在化シーケンス (NLS) が含まれています。デノボ合成直後に核に入り、核を中心にその対策の生体防御機能が実行されます。しかし、感染後の ICP0 のみにある細胞質、HSV-1 感染核-細胞質移行が示唆されました。おそらく ICP0 転座により別の感染段階でその細胞レベル下の場所によるとその機能を調節するための ICP0 です。生物学的機能と ICP0 核・細胞質移行の調節機構を示すために、ICP0 は、HSV-1 感染時に人身売買を監視するための蛍光顕微鏡観察法を変更しました。このプロトコルは、免疫蛍光染色、共焦点顕微鏡イメージング、および核と細胞質分布解析を含みます。このプロトコルの目的は、溶菌感染中 ICP0 運動の定量的なドキュメントに時間コースで撮影した定常共焦点画像を適応することです。ライブ イメージング技術を伴うことがなく他のウイルスや細胞の蛋白質の細胞質局在原子力対を定量的に解析するこの方法を一般化できることを提案します。
概要
単純ヘルペス ウイルス (HSV-1) の 1 により軽度口唇ヘルペス、性器ヘルペス、間質性角膜炎、脳炎など重症のヘルペス性疾患の広い範囲です。一度感染すると、ウイルスは神経節ニューロンに終生潜伏感染を確立します。時折、ウイルスの場合は、発熱、ストレス、免疫抑制1、再発ヘルペス感染症につながるなど様々 な理由で再アクティブ化できます。感染細胞内蛋白質 0 (ICP0) は、溶解と潜熱の HSV-1 感染の重要なキーのウイルス レギュレータです。それは下流のウイルス遺伝子を介してホスト組み込み/自然の抗ウイルス防御2,3に対抗する transactivates します。ICP0 は、プロテアソーム依存低下3のいくつかの細胞因子を対象とする E3 ユビキチン リガーゼ活性があります。それはまた様々 な細胞経路の活動を規制する、その後ホスト抗ウイルスの制限3を相殺すると対話します。ICP0 は、別の細胞内コンパートメントに感染が進む3,4,5を検索する知られています。タンパク質....
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プロトコル
1. 細胞とウイルス感染
- 20-24 h ウイルス感染前に、シード 5 x 10 の4 (HEL) ひと胎児肺線維芽細胞や他の細胞成長培地 (ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% 胎児ウシの 4 も 11 mm ずらしてスライドの検討血清 (FBS))。5% 二酸化炭素 (CO2) 37 ° C でセルを孵化させなさい。
注: 各よく必要があります 70-80% のセル confluency 感染症の時に。 - 次の日に成長培地を削除し、4-10 pfu/セルの範囲に媒体 199 のウイルスの細胞に感染します。37 ° C で 1 時間のウイルスに感染した細胞を孵化させなさい潜伏期間中にスライドを揺れ続けてください。
- 1 時間培養後削除中 199 培地で補うので。
注: この手順またはウイルス吸収する前に、フェーズ別の感染を妨げる薬を追加できます。 - 5% CO2感染期間の様々 な長さの 37 ° C でウイルスに感染した細胞を孵化させなさい。
2. 固定・透過
- 適切な感染症時に、すぐに 3 回リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で感染した細胞を洗浄し、200 μ L の PBS で作りたての 4% パラホルムアルデヒドを追加します。各ウェルに、細胞を修正する室温で 8-10 分のパラ....
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結果
分子基盤と ICP0 は、HSV-1 感染時に人身売買の生物学的機能を理解するには、蛍光顕微鏡観察メソッドを使用して別の感染段階で ICP0 の細胞内分布を解析します。図 1は、感染症が進行するにつれて特徴的な ICP0 ローカリゼーションと代表的な細胞を示しています。ICP0 の核-細胞質の転流を定量化する感染細胞を 3 つのグループに分類することによって核の相対的な ICP0 分布を分析: 核局在化、細胞質局在化、核と細胞質局在 (図 2)。ICP0 は伝染の間に人身売買に必要な要素を理解するには、私たちは別の感染段階で野生型の HSV-1 突然変異体 ICP0 の動きを追跡します。ICP0 の細胞内分布感染の異なる時点での集計結果の例を図 3に示します。
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ディスカッション
このプロトコルは、HSV-1 ICP0 の核-細胞質の転流を研究に使用されています。ICP0 は、HSV-1 感染 (図 1) の細胞内輸送を受けます。おそらく、ICP0 は別の場所で異なる機能を実行する各種の細胞経路と対話します。これにより、人間のホスト13と綱引きの複数機能を微調整する ICP0。しかし、ICP0 が時空の方法で複数の機能を調整する方法はよく研究されていません。上記蛍光顕微鏡のプロトコルと ICP0 核・細胞質移行の分子基盤の解析を始めました。今では、我々 は ICP0 の C 末端を識別したこの転置のために重要な必須の要素として 35 アミノ酸。C 末端がない場合は、ICP0 は感染症 (図 3) 核内で拘束されました。また、発見した、ICP0 E3 リガーゼ依存核保持力遅延、核-に-細胞質移行 U2OS セル12。さらに、我々 は ICP0 C 末端と後半のウイルス蛋白質の表現を核の保持を克服し、細胞.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
海東区受賞 NIH グラント (RO1AI118992) からの財政支援に感謝いたします。テクニカル サポートのウェイン州立大学で顕微鏡、イメージング ・ フローサイトメトリー リソース (MICR) コア施設に感謝いたします。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Cells and viruses | |||
| Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells) | Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University) | HEL細胞をDMEMで増殖させ、10% FBS | |
| HSV-1ウイルスストック(F株) | Dr. Bernard Roizman Lab | ||
| Medium | |||
| ダルベッコ修正されたイーグル」培地 (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| ウシ胎児血清 (FBS) | Sigma | F0926-500ml | |
| Medium-199 (10x) | Gibco | 11825-015 | |
| Reagents | |||
| 4- well 11 mm staggered slide | Cel-Line/Thermofisher Scientific | 30-149H-BLACK | |
| 16% パラホルムアルデヒド溶液(w/v) メタノールフリー | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Fisher 試薬 | BP151-1C0 | |
| ウシ血清アブミン (BSA) | Calbiochem | CAS 9048-46-8 | |
| 馬血清 | シグマ | H1270 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| NaCl | フィッシャーバイオ試薬 | BP358-212 | |
| KH2PO4 | フィッシャーバイオ試薬 | BP362-500 | |
| KCl | フィッシャーサイエンティフィック | BP366-500 | |
| Na2HPO4 | Fisher Bioreagent | BP332-500 | |
| ブロッキングバッファー (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum ) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| Rabiit Anti-ICP0 antibody | Dr. Haidong Gu lab | ||
| PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG | santa Cruz Biotechnology | SC-966 | |
| Alexa Fluor 594-ヤギ抗ウサギ IgG | Invitrogen | A11012 | |
| Alexa Fluor 488-ヤギ抗マウスIgG | invitrogen | A11001 | |
| Vectashield MOUTING MEDIUM with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| パスツールピペット | Fisher Brand | 13-678-20D | |
| Nail Polish | Sally Hansen | ||
| Equipment | |||
| Confocal Microscope | Leica SP8 | ||
| 共焦点ソフトウェア | Leica LAS X アプリケーションスイート | ||
| Excel Excel Excel | |||
| HERAcell 150i CO2 インキュベーター | Thermo Scientific | 注文コード 51026282 |
参考文献
- Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., et al. Pathogenesis and disease. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. Arvin, A., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., et al. Herpes simplex viruses. Fields' Virology. Knipe, D. M. , 6th Edition, Li....
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