ויזואליזציה של נדידת תאים העוסקות ב Tectum אופטיים לפתח הבחורה
Summary
אנו מתארים את פעולות השירות עבור תיוג פלורסנט tangentially גידול תאים על-ידי אלקטרופורציה ולאחר עבור הדמיה בצילום מואץ של התנועה תאים עם תוויות בתרבות שטוח-הר כדי להמחיש נודדות תא התנהגות tectum אופטיים לפתח הבחורה .
Abstract
הדמיה בצילום מואץ היא שיטה חזקה כדי לנתח בהתנהגות התא נודדים. לאחר התא פלורסנט תיוג, ניתן לרשום את התנועה של התאים עם תוויות בתרבות תחת מיקרוסקופ וידאו. לניתוח נדידת תאים במוח המתפתח, התרבות פרוסה משמש בדרך כלל כדי להתבונן נדידת תאים מקבילים למדור פרוסה, כגון נדידת תאים רדיאלי. עם זאת, ניתן להשיג מידע מוגבל השיטה התרבות פרוסה לנתח נדידת תאים בניצב המקטע פרוסה, כגון נדידת תאים וצורניים. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים הדמיה בצילום מואץ להמחיש נדידת תאים העוסקות ב tectum אופטיים לפתח הבחורה. שילוב של התא תיוג על ידי אלקטרופורציה ב ovo ותרבות עוקבות שטוח-mount על תותב התרבות התא מאפשר זיהוי של התא נודדים, בתנועה במישור האופקי. יתר על כן, שיטת שלנו מקלה על גילוי של התנהגות תא בודד וגם פעולה קולקטיבית של קבוצת תאים בטווח הארוך. בשיטה זו ניתן להחיל באופן פוטנציאלי כדי לזהות את השינוי רציפים של התווית על-ידי פלורסנט המיקרו-המבנה, כולל התארכות עצב העקירה עצבית רקמות או תאים בתוך הרקמה ללא עצביות.
Introduction
המחקר של נדידת תאים מתקדמת עם טכניקה לקידום הדמיה בשידור חי. לאחר התא פלורסנט תיוג, התנועה הטמפורלי של תאים עם תוויות תרבות מאכל או ויוו ניתן להקליט תחת מיקרוסקופ וידאו. במחקר של התפתחות עצבית, שינויים מורפולוגיים של נדידת תאים או מתארך אקסונים יש כבר נותחה באמצעות הדמיה בצילום מואץ. עבור הדמיה יעיל, זה חיוני כדי להחיל שיטה מתאימה להכנה תא פלורסנט תיוג ורקמות, בהתבסס על מטרת ניסוי וניתוח. לניתוח נדידת תאים במוח המתפתח, התרבות פרוסה כבר בשימוש נפוץ להתבונן נדידת תאים מקבילים למדור פרוסה, כגון תא רדיאלי ההעברה1,2,3. מערכת התרבות פרוסה משמש גם לגילוי תא וצורניים ההעברה4,5, אבל זה לא מתאים לניתוח כיוונית במקרים שבו התאים לפזר בניצב בסעיף פרוסה.
Tectum סיב אופטי מורכב מבנה מרובה שכבות, שהוקמה על ידי נדידת תאים רדיאלי, וקולו במהלך התפתחות עובריים. היווצרות שכבה tectal תלוי בעיקר ההעברה רדיאלי של קודמן עצביים postmitotic תאים מאזור חדרית, היעד הסופי שלהם ברבדים בקורלציה עם תאריך הלידה שלהם ב אזור חדרית6. באשר וצורניים ההעברה, דיווחנו בעבר שני זרמים של העברות בשכבות הביניים ושיטחית ב tectum אופטיים המתפתח הבחורה. בשכבות הביניים במהלך E6-E8, התאים דו קוטבי עם תהליך ארוך המובילים ותהליך נגרר דק נודדים dorsally או ventrally לאורך fasciculus האקסון של אקסונים efferent tectal הפועלות dorso-ventrally7. לאחר העברה זו axophilic, התאים להבדיל לתוך הנוירונים multipolar הנמצא בשכבות העמוקות. בשכבות שטחיות במהלך E7-E14, התאים נודדים לפזר בצורה אופקית על ידי רפורמה תהליך המוביל מסועף ופיזור לתוך כיוונים מספר8. לאחר פיזור ההעברה, התאים האחרונים להבדיל בסופו של דבר לתוך הנוירונים שטחית מורפולוגיות שונות. בשני המקרים, תרבות שטוח-הר יעיל כדי לבחון את תנועת התא מקביל פני השטח pial.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול הדמיה בצילום מואץ להמחיש נדידת תאים לתעל פיתוח צ’יק tectum סיב אופטי7,8. שילוב של התא תיוג על ידי אלקטרופורציה ב ovo, ותרבות עוקבות שטוח-mount על הוספה התרבות תאים מאפשרת גילוי של כיוון התנועה והעברה תא נודדים. המטרה של שיטה זו היא כדי להקל על הזיהוי של שני התנהגות תא בודד לטווח הארוך, פעולה קולקטיבית של קבוצת תאים במישור האופקי.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר לעיל ממוטבת לגילוי נדידת תאים שכבות שטחיות6,8. הוא ישים לגילוי שכבה אמצעית ההעברה נחלים (סרט 5)6,7, רק על ידי הסטה העיתוי של אלקטרופורציה (E5.5 כדי E4.5) ואת תחילתה של תרבות והדמיה (E7.0 כדי E6.0).
<p clas…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מספר גרנט KAKENHI JSPS 15 06740 K כדי לעותר
Materials
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
References
- Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
- Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging. Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).
- Martini, F. J., et al. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136, 41-50 (2009).
- Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling. Development. 129, 3147-3160 (2002).
- Watanabe, Y., Yaginuma, H. Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum. Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum. Development. 141, 3572-3582 (2014).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum. Developmental Biology. 437, 131-139 (2018).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Cordelières, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLOS One. 8, e81266 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
