개발 병아리 광섬유 Tectum에 접선 셀 이동의 시각화
Summary
형광 라벨 tangentially 마이그레이션에 대 한 방법을 설명 셀 electroporation, 그리고 마이그레이션 시각화 하기 위해 플랫-마운트 문화에서 레이블이 지정 된 셀 이동의 시간 경과 영상 셀 개발 병아리 광섬유 tectum에 동작 .
Abstract
시간 경과 영상 마이그레이션 셀 동작을 분석 하는 강력한 방법입니다. 형광 셀 라벨, 후 비디오 현미경 아래 문화에 레이블이 지정 된 세포의 움직임을 기록할 수 있습니다. 개발 두뇌에 셀 마이그레이션 분석, 대 한 조각 문화는 셀 마이그레이션 방사형 셀 마이그레이션 등의 조각 섹션에 평행 하 게 관찰 하에 주로 사용 됩니다. 그러나, 슬라이스 문화 방법 접선 셀 마이그레이션 등의 조각 섹션에 수직 셀 마이그레이션 분석 하에서 제한 된 정보를 얻을 수 있습니다. 여기, 우리는 시각화 개발 병아리 광섬유 tectum에 접선 셀 마이그레이션 시간 경과 영상에 대 한 프로토콜을 제시. 셀 라벨 electroporation에서 비켜에서 문화와 후속 플랫-마운트 셀 문화 삽입에 의해의 조합 수평 평면에 마이그레이션 세포 운동의 감지 수 있습니다. 또한, 우리의 방법은 개별 셀 동작 및 장기적으로 세포의 그룹의 집단 행동의 탐지를 촉진 한다. 이 방법은 잠재적으로 형광 표시 된 마이크로-구조, axonal 신장 비 신경 조직의 신경 조직 또는 세포 치환 등의 순차적 변화를 감지에 적용할 수 있습니다.
Introduction
세포 이동의 연구 라이브 이미징의 발전 기법으로 진행 되었습니다. 형광 셀 라벨, 후 비디오 현미경 아래 문화 접시 또는 vivo에서 레이블이 지정 된 셀의 시간적 움직임을 기록할 수 있습니다. 신경 개발 연구에서 세포를 마이그레이션하거나 elongating axons의 형태학 변화 되었습니다 분석 했습니다 시간 경과 화상 진 찰을 사용 하 여. 효과적인 이미징에 대 한 형광 셀 라벨 및 조직 준비, 실험 및 분석의 목적에 따라 적당 한 방법을 적용 하는 필수적 이다. 개발 두뇌에 셀 마이그레이션 분석, 대 한 조각 문화는 셀 마이그레이션 방사형 셀 마이그레이션1,2,3등의 조각 섹션에 평행 하 게 관찰 하 일반적으로 사용 되었습니다. 조각 문화 시스템은 접선 셀 마이그레이션4,5, 검색에 사용 하지만 셀 슬라이스 섹션에 수직을 분산 하는 경우에 방향 분석에 적합 하지 않습니다.
광섬유 tectum는 배아 개발 하는 동안 레이디얼 및 접선 셀 마이그레이션에 의해 형성 된 다층 구조의 구성 됩니다. Tectal 계층 형성 된 심 실 영역에서 postmitotic 신경 선구자 세포의 방사형 마이그레이션에 주로 의존 하 고 층에서 그들의 최종 목적지는 심 실 지역6에 그들의 출생 날짜와 상관 관계가. 접선 이동에 관해서는 우리는 이전 마이그레이션 개발 병아리 광섬유 tectum에 중간과 표면 층에서 두 개의 스트림을 보고. E6-E8 중 중간 층에서 긴 주요 프로세스와 얇은 후행 프로세스 양극 세포 dorso ventrally7실행 tectal 원심 성 축 삭의 축 삭 fasciculus 따라 dorsally 또는 ventrally 마이그레이션합니다. 이 axophilic 마이그레이션 후 셀 깊은 층에 있는 다 극 신경 세포로 분화. E7-E14 중 표면 층에서 마이그레이션 셀 가로로 여러 방향8로 분기 주요 프로세스 및 분산형 개혁에 의해 분산. 마이그레이션, 분산 후 후자의 셀 결국 다양 한 형태학의 피상적인 뉴런으로 분화. 두 경우 모두, 평면 산 문화 pial 표면에 병렬 셀 운동 관찰 효율적입니다.
여기, 선물이 접선 셀 마이그레이션 개발 병아리 광섬유 tectum7,8에서 시각화 하 시간 경과 영상에 대 한 프로토콜. 셀 라벨 electroporation에서 비켜에서문화와 후속 플랫-마운트 셀 문화 삽입에 의해 한 마이그레이션 셀 이동 및 마이그레이션 방향 감지가 있습니다. 이 방법의 목표는 장기와 수평 평면에 있는 셀의 그룹의 집단 행동에 두 개별 셀 동작의 탐지를 촉진.
Protocol
Representative Results
Discussion
위에서 설명한 프로토콜 표면 레이어6,8셀 마이그레이션 감지 최적화 되어 있습니다. 그것은 이동 electroporation (E4.5에 E5.5)의 타이밍 및 문화의 발병 및 이미징 (E6.0에 E7.0) 그냥 중간 계층 마이그레이션 스트림영화 ( 5)6,7, 탐지를 위해 적용 가능한.
제시 하는 절차?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 JSP KAKENHI 그랜트 수에 의해 지원 되었다 Y.W.에 15 K 06740
Materials
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
References
- Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
- Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging. Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).
- Martini, F. J., et al. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136, 41-50 (2009).
- Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling. Development. 129, 3147-3160 (2002).
- Watanabe, Y., Yaginuma, H. Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum. Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum. Development. 141, 3572-3582 (2014).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum. Developmental Biology. 437, 131-139 (2018).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Cordelières, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLOS One. 8, e81266 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
