Visualisation de la Migration cellulaire tangentielle dans le Tectum optique de poussin en développement
Summary
Nous décrivons les méthodes de marquage fluorescent tangentiellement liés à la migration des cellules par électroporation et pour l’imagerie Time-lapse du mouvement cellulaire étiquetées dans une culture de montage plat afin de visualiser la migration cellulaire comportement dans le tectum optique de poussin en développement .
Abstract
Time-lapse imagerie est une méthode puissante pour analyser le comportement de cellules migratrices. Après cellule fluorescente d’étiquetage, le mouvement des cellules marquées en culture peut être enregistré sous microscopie vidéo. Pour l’analyse de la migration cellulaire dans le développement du cerveau, tranche la culture est couramment utilisée pour observer la migration cellulaire parallèle à la section de la tranche, comme la migration de cellules radiales. Cependant, peu d’informations peut être obtenue de la méthode de culture de tranche pour analyser la migration cellulaire perpendiculaire à la section de la tranche, notamment la migration cellulaire tangentielle. Nous présentons ici les protocoles d’imagerie de Time-lapse afin de visualiser la migration tangentielle cellulaire dans le tectum optique de poussin en voie de développement. Une combinaison de cellules étiquetant par électroporation in ovo et une culture de plat-montage ultérieure sur l’insert de culture cellulaire permet une détection des mouvements de cellules migratrices dans le plan horizontal. De plus, notre méthode facilitant la détection de comportement de la cellule individuelle et l’action collective d’un groupe de cellules à long terme. Cette méthode peut potentiellement être appliquée pour détecter la modification séquentielle de la fluorescent-étiquetées microstructure, y compris l’allongement axonale dans le déplacement de tissu ou de cellules neural dans le tissu non neural.
Introduction
L’étude de la migration cellulaire progresse avec la technique avancée d’imagerie live. Après cellule fluorescente d’étiquetage, le mouvement temporel de cellules marquées dans une boîte de Petri ou in vivo peut être enregistré sous microscopie vidéo. Dans l’étude du développement neuronal, les modifications morphologiques de la migration des cellules ou allongeant des axones ont été analysées à l’aide de l’imagerie Time-lapse. Pour l’imagerie efficace, il est essentiel d’appliquer une méthode appropriée pour la préparation d’étiquetage et de tissu cellulaire fluorescent, fondée sur le but de l’expérience et l’analyse. Pour l’analyse de la migration cellulaire dans le développement du cerveau, tranche la culture a été couramment utilisée pour observer la migration cellulaire parallèle à la section de la tranche, comme la cellule radiale migration1,2,3. Le système de culture de tranche est également utilisé pour détecter les tangentielles cell migration4,5, mais ce n’est pas adapté à l’analyse directionnel dans les cas où les cellules dispersent perpendiculaire à la section de la tranche.
Le tectum optique est composé d’une structure multicouche, formée par la migration des cellules radiales et tangentielles durant le développement embryonnaire. Formation de couche tectal dépend essentiellement des migrations radiales des cellules postmitotiques précurseurs neuronaux de la zone ventriculaire, et leur destination finale dans les couches est en corrélation avec leur date de naissance dans la zone ventriculaire6. En ce qui concerne la migration tangentielle, nous avons déjà indiqué deux flux de migrations dans les couches moyennes et superficielles dans un pays en développement tectum optique de poussin. Dans les couches intermédiaires pendant E6-E8, les cellules bipolaires avec un processus long de premier plan et un processus de fin mince migrent sur le dos ou sur le ventre le long de la fasciculus axone des opposantes axones efférents qui exécutent dorso-ventralement7. Après cette migration d’axophilic, les cellules se différencient en neurones multipolaires situés dans les couches profondes. Dans les couches superficielles pendant E7-E14, les cellules migratrices dispersent horizontalement en réformant un processus principaux ramifiés et dispersion dans plusieurs directions8. Après la dispersion de migration, les cellules de ces derniers se différencient finalement en neurones superficiels de morphologies différentes. Dans les deux cas, une culture de plat-Mont est efficace pour observer le mouvement cellulaire parallèle à la surface pial.
Nous présentons ici un protocole pour le Time-lapse d’imagerie afin de visualiser la migration tangentielle cellulaire dans les pays en développement poussin tectum optique7,8. Combinaison de cellule l’étiquetage par électroporation in ovoet une culture de plat-montage ultérieure sur l’insert de culture cellulaire permet la détection des migrateur direction de mouvement et de la migration cellulaire. Cette méthode vise à faciliter la détection des deux comportement de cellules individuelles dans le long terme et l’action collective d’un groupe de cellules dans le plan horizontal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ci-dessus est optimisé pour la détection de la migration cellulaire dans les couches superficielles6,8. Elle est applicable pour la détection de couche intermédiaire migration flux (film 5)6,7, juste en déplaçant le timing de l’électroporation (E5.5 à E4.5) et l’apparition de la culture et en imagerie (E7.0 à E6.0).
<p class="jove_co…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI Grant Number 15K 06740 à Y.W.
Materials
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
References
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