Visualisering av tangentiella cellmigration i den framkallande Chick fiberoptiska Tectum
Summary
Vi beskriver metoderna för fluorescerande märkning av tangentiellt migrera cellerna av elektroporation och för time-lapse avbildning av märkt cell rörelse i en platt-mount kultur för att visualisera migrera cell beteende i den framkallande chick fiberoptiska tectum .
Abstract
Time-lapse bildbehandling är en kraftfull metod för att analysera migrera cell beteende. Efter fluorescerande cell märkning, kan förflyttning av de märkta cellerna i kultur registreras under video mikroskopi. För att analysera cellmigration i hjärnans utveckling, används slice kultur ofta att observera cellmigration parallell till avsnittet slice, som radiella cellmigration. Dock kan begränsad information erhållas från metoden slice kultur att analysera cellmigration vinkelrätt till avsnittet slice, som tangerar cellmigration. Här presenterar vi protokollen för time-lapse imaging att visualisera tangentiella cellmigration i den framkallande chick fiberoptiska tectum. En kombination av cell märkning av elektroporation i ovo och en efterföljande platt-mount kultur på cell kultur skäret ger detektering av migrerar cellers rörelser i horisontalplanet. Dessutom underlättar vår metod upptäckt av både enskild cell beteende och de fackliga stridsåtgärder av en grupp av celler på lång sikt. Denna metod kan potentiellt användas för att upptäcka den sekventiell förändringen av lysrör-märkt mikro-struktur, inklusive den axonal töjning i neurala vävnader eller celler förskjutningen i den icke-nervvävnad.
Introduction
Studien av cellmigration har framskridit med de framryckande tekniken för levande imaging. Efter fluorescerande cell märkning, kan den temporal rörligheten för märkta celler i en kultur maträtt eller i vivo registreras under video mikroskopi. I studien av neural utveckling, har de morfologiska förändringarna av migrera celler eller elongating axoner analyserats med hjälp av time-lapse imaging. För effektiv bildbehandling är det viktigt att tillämpa en lämplig metod för fluorescerande cell märkning och vävnad förberedelse, baserat på syftet med de experiment och analyser. För att analysera cellmigration i hjärnans utveckling, använts slice kultur ofta att observera cellmigration parallell till avsnittet segment, såsom radiella cell migration1,2,3. Systemets slice kultur används också för att upptäcka tangentiella cell migration4,5, men det passar inte för riktad analys i fall där cellerna skingra vinkelrätt till avsnittet slice.
Den fiberoptiska tectum består av ett mångbottnat struktur, bildas av radiell och tangentiell cellmigration under fosterutvecklingen. Tectal lager bildas beror främst på radiella migration av postmitotic neuronala föregångare celler från zonen ventrikulära och slutdestinationen i lager korrelerar med deras födelsedatum i ventrikulära zon6. När det gäller tangentiella migration rapporterat vi tidigare två strömmar av migreringar i mitten och ytliga lagren i en utvecklande chick fiberoptiska tectum. I de mellersta skikten under E6-E8 migrera de bipolära cellerna med en länge ledande och en tunn avslutande processen dorsalt eller ventralt längs de axon fasciculus av tectal efferent axoner som kör dorso-ventralt7. Efter denna axophilic migration differentieras cellerna till multipolär nervceller som ligger i de djupa skikten. I de ytliga lagrarna under E7-E14 skingra de migrera cellerna vågrätt genom att reformera en förgrenad ledande process och scatter i flera riktningar8. Efter dispergering migration, differentieras senare cellerna så småningom till ytliga nervceller av olika morfologier. I båda fallen är en platt-mount kultur effektiva att iaktta cell rörelse parallell till pial ytan.
Här presenterar vi ett protokoll för time-lapse imaging att visualisera tangentiella cellmigration i utvecklingsländer chick fiberoptiska tectum7,8. Kombinationen av cell märkning av elektroporation i ovooch en efterföljande platt-mount kultur på cell kultur skäret ger detektering av migrera cell rörlighet och migration riktning. Målet med denna metod är att underlätta identifiering av både enskild cell beteende på lång sikt och de fackliga stridsåtgärder av en grupp av celler i horisontalplanet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det protokoll som beskrivs ovan är optimerad för att upptäcka cellmigration i ytliga lager6,8. Det gäller att upptäcka mellanlager migration strömmar (film 5)6,7, bara genom skiftande tidpunkten för elektroporation (E5.5 till E4.5) och uppkomsten av kultur och imaging (E7.0 till E6.0).
Presenterade förfarandet består av cell märkning…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av JSPS KAKENHI licensnummer 15K 06740 till Y.W.
Materials
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
References
- Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
- Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging. Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).
- Martini, F. J., et al. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136, 41-50 (2009).
- Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling. Development. 129, 3147-3160 (2002).
- Watanabe, Y., Yaginuma, H. Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum. Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum. Development. 141, 3572-3582 (2014).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum. Developmental Biology. 437, 131-139 (2018).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Cordelières, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLOS One. 8, e81266 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
