Her beskriver vi en protokoll for å måle glomerular filtrering rate (GFR) i bevisst, fritt flytte mus med en transdermal GFR skjerm.
Transdermal er glomerular filtrering rate (GFR) en etablert teknikk som brukes til å vurdere nyrefunksjonen i musen og rotte modeller av akutt nyre skader og kronisk nyresykdom. Målesystemet består av en miniatyriserte fluorescens detektor som er direkte knyttet til huden på baksiden av bevisst, fritt bevegelige dyr, og måler utskillelse kinetics av de ytre GFR tracer, fluorescein-isothiocyanate (FITC) konjugert sinistrin (en inulin analog). Dette systemet har blitt beskrevet i detalj i rotter. Men på grunn av deres mindre størrelse presenterer måling av transkutan GFR i mus flere tekniske utfordringer. I dette papiret gir vi derfor den første detaljert praktisk guiden til bruk av transdermal GFR skjermer i mus basert på de kombinert erfaringen med tre forskjellige etterforskere som har vært utført denne analysen i mus over flere år.
Bruk av transkutan GFR skjermer i mus ble først rapportert av Schreiber og kolleger i 2012 og ble validert ved å sammenligne GFR målinger Hentet ved hjelp av denne teknikken, med resultatene oppnås ved direkte måling av FITC-sinistrin bolus klaring fra seriell blodprøver1. Hittil har det vært 35 fagfellevurderte publikasjoner som transkutan GFR skjermer har blitt brukt i rotter og mus (en liste over artikler og konferansen Sammendrag hvor prekliniske GFR skjermen ble brukt kan finnes på den MediBeacon nettstedet2). Transdermal GFR mål i rotter og mus har blitt beskrevet i en rekke publikasjoner1,3,4,5, og en video tutorial som viser bruken rotter har vært publisert6. Imidlertid presenterer måling i mus flere tekniske utfordringer. Her gir vi den første detaljert praktisk guiden til bruk av transdermal GFR skjermer i mus.
Det finnes en rekke grunner Hvorfor etterforskere begynner å favorisere bruk av transdermal GFR skjermer å vurdere nyrefunksjonen på gnager modeller. Transdermal måling av FITC-sinistrin klaring har vist seg å gi et mer følsomme og nøyaktige mål nyrefunksjonen sammenlignet med tradisjonelle parameterne for nyre funksjon som serum creatinine og blod urea nitrogen (BUN)7, 8. Ved å implementere en forbedret evaluering algoritme, vist Friedemann og kolleger at systemet når presisjon sammenlignes med gull standard, konstant tilførsel teknikken for GFR måling3. Nyere studier har også vist at sekvensiell analyse bruker transkutan GFR skjermer kan brukes til å studere tidlig endringer i nyre-funksjon i tillegg til funksjonelle utvinning etter induksjon av akutt nyre skader (AKI) uten å forstyrre dyr blod volum eller hemodynamics, blod siden analysen ikke krever sammenhengende prøvetaking9,10. Muligheten til å måle GFR med høy presisjon og følsomhet flere ganger i samme dyr gjør denne teknikken attraktive for en rekke forskjellige forskningsdisipliner. Transdermal GFR skjermer har blitt brukt av legemiddelindustrien for å vurdere toksisitet av romanen forbindelser og universiteter for grunnleggende og translasjonsforskning forskning.
Dette manuskriptet og på trening videoen gir praktiske retningslinjer for bruk av transdermal GFR skjermer i mus. De viktigste trinnene i prosedyren er riktig feste enheten på dyrets tilbake, og sikkert innpakning målebåndet rundt magen. Den beste posisjonen er litt venstre eller høyre på midtlinjen, over brystkasse. Oppdateringen og enheten må være godt festet til huden, men de bør ikke være så stramt at de begrenser pust, bevegelse, eller påvirke huden blodsirkulasjonen under enheten, da dette vil føre til feil/unøyaktige målinger. I tillegg siden overvåking oppstår i bevisst mus etter at de har gjenvunnet fra anestesi, korrekt plassering av enheten fra kroppen med lavest forstyrrelser fra bevegelse resultater i transdermal målinger med liten bevegelse gjenstander. Derfor er det viktig at enheten ikke er plassert for nært til øvre lemmer slik at mus kan flytte skuldrene fritt.
Det er viktig å epilere meg musene én til to dager før GFR måling, som Versace påvirker måling av FITC-sinistrin fortolling, med innledende data indikerer at hårfjerning umiddelbart før måling av transdermal GFR øker den tilsynelatende halveringstiden av FITC-sinistrin. Mekanismen for dette er ukjent. Derfor, for å få pålitelige målinger over flere tidspunkt og mellom eksperimenter, er det tilrådelig å epilere meg musene på forhånd, slik at huden til å gjenopprette fra denne prosessen før du fortsetter med GFR målinger. Hårfjerning krem bør ikke brukes til det samme området av huden innen 72 timer av et tidligere program, å unngå kjemisk skade huden. I mange tilfeller pels ettervekst tar flere dager eller opptil en uke, og så re-søknad av hårfjerning krem innen 72 timer kan lett unngås.
Fordi opp til 50% av serum creatinine skilles ut av rørformede delen i mus13, og fordi det er økt reabsorpsjon av urea fra nyre tubuli når mus er dehydrert14, serum creatinine og BUN er dårlig markører på nyre funksjon. Men på grunn av deres bekvemmelighet fortsatt disse analyser brukes som viktigste mål på nyre funksjon i preklinisk studier av AKI og Parallelt i mus. Men i samsvar med store bidrag av rørformede sekresjon til creatinine utskillelse i mus med normal eller nær normal nyrefunksjonen13, serum creatinine viste liten sammenheng med FITC-sinistrin klaring på høy klareringsrate (lav FITC-sinistrin half-life), som indikerer at creatinine er en ufølsom mål nyrefunksjonen i mus med mild nyre skader. I kontrast, mens BUN samsvarer med FITC-sinistrin klarering i mus med mild nedsatt nyrefunksjon, er det dårlig sammenheng mellom BUN og FITC-sinistrin klarering i mus med mer alvorlige nyre skader (høy FITC-sinistrin half-life). Dette skyldes trolig virkningene av urea reabsorpsjon tilknyttet dehydrering i syke dyr med alvorlig nyre skader.
En stor fordel av transdermal GFR måling, sammenlignet med alle andre bolus klarering eller konstant tilførsel teknikker for GFR måling, er at den ikke krever nøye timet blod og urin samlinger. Dette kan være spesielt utfordrende i mus som har lav total blod volum og urin produksjon sammenlignet med rotter. Videre må mus håndteres for vedlegg av enhet og injeksjon, men ikke for flere venipunctures, som kreves for klassisk bolus klaring eksperimenter15. Videre varigheten av anestesi er kort, og som sådan er det mulig å utføre gjentatte målinger i individuelle mus over tid. Frekvensen som målinger kan utføres primært avhengig helsetilstanden til mus, forskeren evner for intravenøs injeksjoner og institusjonelle batterier på gjentatte anestesi økter. I sunn, uskadet mus, kan transdermal GFR målinger utføres daglig, med minimal eller ingen negative effekter på musen. Imidlertid skadet mus lider av AKI eller Parallelt er usannsynlig å tåle gjentatt anestesi økter som sunn musene, og dermed frekvensen av målinger skal reduseres.
Hovedbegrensningen transdermal GFR måling, sammenlignet med bolus klaring metoder å måle GFR i mus er at utskillelsen kinetics måles bare endringer i relativ fluorescens intensitet over tid, og ikke absolutt tracer konsentrasjoner. Derfor er det bare mulig å måle hastigheten konstant of enkelt eksponentiell nedbrytning av utskillelsen kinetic, som er et nært anslag over GFR normalisert ekstracellulære volum16. For å uttrykke GFR i mL/min, har det ekstracellulære volumet av dyret fastsettes ved hjelp av en konverteringsfaktor som ble etablert i tidligere studier som samtidig målinger av plasma konsentrasjoner av FITC-sinistrin ble utført1. Men denne konverteringsfaktor kan ikke riktig anslo ekstracellulære flytende volumer like bra i alle mus, siden væske volum kan påvirkes av en rekke utenforliggende faktorer inkludert alder, kjønn, hydration status (som påvirkes av kirurgiske intervensjoner samt nyre skader), og17. Men i motsetning til bolus dosering metode for å vurdere GFR i mus er transkutan GFR måling underlagt mindre operatøravhengig variasjon som den ikke påvirkes av dosering feil eller feil i timingen av blod.
En annen begrensning transkutan GFR måleverdien teknikken er at planlagte signal Skift kan oppstå i løpet av målingen på grunn av bleking hud fluorophores og anestesi kreves for enhet vedlegg og tracer injeksjon. Denne begrensningen ble behandlet av Friedemann og kolleger ved å implementere en korreksjon algoritmen3. Gjennomføringen av denne algoritmen førte til en forbedring i presisjon av transdermal teknikken sammenlignes med konstant tilførsel teknikk GFR vurdering.
Et vanlig spørsmål er om pigmentering i annen mus stammer påvirker transdermal FITC-sinistrin klarering. Pigmentering reduserer FITC-sinistrin signal intensiteten siden mørke pigmenter absorberer blå magnetisering og grønne utslipp signaler fra FITC-sinistrin målinger. Men frekvensen utskillelse av FITC-sinistrin er uavhengig av totalt signalet intensitet. Videre mens målt signalet er lavere, er bakgrunn signalet også lavere pigmentert mus. Bakgrunn signalet er en blanding av autofluorescence av hud fluorophores og refleksjon av eksitasjon lyset, har vi funnet at bakgrunnen til maksimalt signalet er sammenlignbare, eller enda bedre, i pigmentert dyr. I tillegg bevegelse gjenstander, som er forårsaket av eksponering av omkringliggende huden å reflektert lys, reduseres i pigmentert mus siden det reflekterte lyset er også absorbert av pigmentert hud.
Avslutningsvis lar teknikken vi har presentert nøyaktig måling av GFR i bevisst, fritt flytte mus for alle hudtyper. Teknikken er uavhengig av blodprøve, kan det brukes flere ganger på samme dyret for langsgående observasjoner i Parallelt modeller, samt for måling av raske endringer i GFR som oppstår etter induksjon av AKI.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Vanderbilt Center for nyre sykdom (VCKD), og ble delvis finansiert av følgende tilskudd: DOD PR161028 og R01DK112688 (Mark de Caestecker)
Vi erkjenner støtte til LS, PM og BW av MRC, EPSRC og BBSRC-finansierte UK regenerativ medisin plattform “Sikkerhet og effekt, fokus på Imaging teknologi Hub” (MR/K026739/1).
Transdermal GFR monitor (comes with 1 device, 2 batteries and 1 charger) | MediBeacon GmbH | TDM-MH001 | Reading software: MPD Lab; Analysis software: MPD Studio |
Additional Batteries | MediBeacon GmBH | PWR-BT0001 | |
Attachment patches | MediBeacon GmbH | small: PTC-SM001; large: PTC-LG001 | |
FITC-sinistrin | MediBeacon GmbH | FTC-FS001 | |
Hypoallergenic silk tape | e.g. Durapore (1538-2), or Kendall (7138C), or Leukosilk (01032-00) | ||
Anaesthesia chamber, isoflurane, oxygen | |||
Heat pad | |||
Electric shaver | |||
Depilatory (hair removal) cream | e.g. Veet or Nair | ||
Cotton buds | |||
Cotton swabs | |||
Timer | |||
Scales | |||
70% ethanol wipes |