Att kombinera Histochemical färgning och bildanalys att kvantifiera stärkelse i de äggstock Primordia Sweet Cherry under vintern dvala
Summary
Vi presenterar en metodik för att kvantifiera hur mycket stärkelse i de äggstock primordia i sötkörsbär (Prunus avium L.) under vintern dvala med hjälp av en bild analyssystem kombinerat med histochemical metoder.
Abstract
Förändringar i stärkelse i små strukturer är associerade med viktiga händelser under flera växt-utvecklingsprocesser, inklusive den reproduktiva fasen från pollinering befruktning och uppkomsten av bära frukt. Dock är variationer i stärkelse under blomma differentiering inte helt kända, främst på grund av svårigheten att kvantifiera hur mycket stärkelse i de blomma primordia särskilt små strukturer. Här, beskriver vi en metod för kvantifiering av stärkelse i de äggstock primordia av sötkörsbär (Prunus avium L.) genom att använda en bild analyssystem kopplade till mikroskopet, som tillåter avseende förändringar i stärkelseinnehåll med olika faser i dvala från höst till vår. För detta ändamål bestäms dvala status av blomknoppar genom att utvärdera bud tillväxt av skott som överförts till kontrollerade förhållanden vid olika tidpunkter i vintertid. För kvantifiering av stärkelse i de äggstock primordia, blomknoppar är sekventiellt samlas in, fast, inbäddade i paraffin vax, sektioneras och fläckade jag2Kl (kaliumjodid-jod). Preparat är observerade under mikroskopet och analyseras av en bild-analysator som tydligt skiljer stärkelse från bakgrunden. Stärkelse innehåll värden erhålls genom att mäta den optiska densiteten av bilden som motsvarar den färgade stärkelsen, med tanke på summan av varje pixel optiska densitet som en uppskattning av stärkelse av ramen studerade.
Introduction
Tempererade vedartade perenner anpassas till årstiderna genom att modulera deras tillväxt och utveckling. Medan de utvecklas under våren och sommaren, slutar de växa under hösten att gå vilande i vinter1. Även om dvala tillåter dem att överleva på låga vintertemperaturer, är kylning en förutsättning för en korrekt budburst i spring2. De viktiga konsekvenserna av dvala i tempererade fruktproduktion och skogsbruk har lett till olika insatser att avgöra och förutsäga den dvala period3. I frukt trädslag, empiriska experiment överföra skott till tvingar villkor och statistiska prognoser baserade på data av blomning är nuvarande metoder att bestämma datum för brytande av dvala, som tillåter forskare att uppskatta den kylning kraven för varje sort. Hur man bestämmer dvala status baserat på biologiska processer är dock fortfarande oklart3.
Blommande i tempererade fruktträd, såsom sötkörsbär (Prunus avium L.), inträffar en gång per år och varar ungefär två veckor. Men börja blommorna differentiera och utveckla ca 10 månader tidigare, under den föregående sommar4. Blomma primordia slutar växa under hösten för att förbli vilande inuti knopparna under vintern. Under denna period måste varje sort att ackumulera en viss kylning kravet för korrekt blommande4. Trots avsaknaden av fenologiska förändringar i knopparna under vintern, blomma primordia är fysiologiskt aktiva under dvala, och ansamling av kylning temperaturer nyligen har associerats med dynamiskt stärkelse ackumulation eller minska i cellerna i den äggstock primordium, erbjuder en ny strategi för dvala bestämning5. Men kräver den lilla storleken och placeringen av den äggstock primordium en speciell metodik.
Stärkelse är den stora lagring kolhydrat i woody växt arter6. Således, förändringar i stärkelse har anknytning till den fysiologiska aktiviteten av blomma vävnader, som behöver kolhydrater att stödja deras utveckling7,8. Olika viktiga händelser under den reproduktiva processen relateras också till variationer i stärkelse i olika blommiga strukturer, såsom anther meios9, tillväxten av pollen rören genom den stil eller fröämnet befruktning10. Histochemical metoder Tillåt påvisande av stärkelse i varje särskild vävnad av de blomma primordia under dvala. Svårigheten är dock fortfarande kvantifiera den stärkelsen att tillåta efter sitt mönster av ackumulering/minskning över tid eller jämföra stärkelsen innehåll bland vävnader, sorter eller år. Detta beror på den lilla mängden vävnad tillgänglig för analytiska tekniker11. Som ett alternativ tillåter bildanalys kopplat till mikroskopi12 kvantifiering av stärkelsen i mycket små prover av växt vävnaden13.
Strategier som kombinerar Mikroskopi och bildanalys har använts för att kvantifiera innehållet i olika komponenter i växt vävnader, såsom callose14, mikrorör15, eller stärkelse16, genom att mäta storleken på det område som färgats av specifika fläckar. För stärkelse, det kan lätt påvisas med hjälp av kaliumjodid-jod (jag2KI) reaktion17. Denna metod är mycket specifika; Jag2KI intercalates inom laminar struktur stärkelse korn och bildar en mörk blå eller rödbrun färg, beroende på amylose innehåll av stärkelse18. Sektioner är fläckade av jag2KI fläcken visar tillräcklig kontrast mellan stärkelse och bakgrunden vävnad, vilket gör att en otvetydig stärkelse upptäckt och efterföljande kvantifieringen av bild analys system19. Även detta färgämne inte är stökiometriska, är ansamling av jod proportionell till längden av stärkelse molekylen, som kan starkt variera17. Således, storleken på det färgade området uttryckt som antalet pixlar kanske inte återspeglar exakt innehållet av stärkelse, eftersom hög skillnader i stärkelseinnehåll kunde hittas mellan fält med färgade områden av liknande storlek. Som ett alternativ, kan stärkelse utvärderas genom att mäta de färgade granulerna på svartvita bilder från mikroskopet, optiska densitet som det har rapporterats i olika vävnader i aprikos8,13 , 19, avokado10,20och oliv21.
Här beskriver vi en metodik som kombinerar experimentell bestämning av dvala status med kvantifiering av stärkelsehalten i äggstocken primordium vävnaden från höst till vår i sweet cherry, erbjuder ett nytt verktyg för förståelse och förutsägelse dvala baserat på studier av de biologiska mekanismerna koppling till dvala.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dvala i woody perenner presenterar tydliga konsekvenserna i fruktproduktion och skogsbruk i ett förändrat klimat, även om den biologiska processen bakom dvala oklar. Dvala studier kan behandlas ur olika synvinklar, men forskningen letar du efter en biologisk markör för vintern dvala har intensifierats de senaste åren. De flesta försök att hitta en entydig indikator som visar när en knopp har brutit dvala har dock misslyckade3. De metoder som beskrivs häri, att kombinera histochemical met…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tacka tacksamt Maria Herrero och Eliseo Rivas för deras bra diskussion och råd. Detta arbete stöds av Ministerio de Economía y Competitividad — Europeiska regionalutvecklingsfonden, Europeiska unionen [grant number BES-2010-037992 till E. F.]; Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria [grant nummer RFP2015-00015-00, RTA2014-00085-00, RTA2017-00003-00]; och de Gobierno de Aragón — Europeiskasocialfonden, Europeiska unionen [Grupo Consolidado A12-17R].
Materials
| Precision scale | Sartorius | CP225D | |
| Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | MZ-16 | |
| Drying-stove | Memmert | U15 | |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems | EG1140H | |
| Rotatory microtome | Reichert-Jung | 1130/Biocut | |
| Microtome blade | Feather | S35 | Stainless steel |
| Bright field microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| Digital Camera | Leica Microsystems | DC-300 | |
| Image Analysis System | Leica Microsystems | Quantiment Q550 |
References
- Kurokura, T., Mimida, N., Battey, N. H., Hytönen, T. The regulation of seasonal flowering in the Rosaceae. Journal of Experimental Botany. 64 (14), 4131-4141 (2013).
- Rohde, A., Bhalerao, R. P. Plant dormancy in the perennial context. Trends in Plant Science. 12 (5), 217-223 (2007).
- Fadón, E., Rodrigo, J. Unveiling winter dormancy through empirical experiments. Environmental and Experimental Botany. 152, 28-36 (2018).
- Fadón, E., Rodrigo, J., Herrero, M. Is there a specific stage to rest? Morphological changes in flower primordia in relation to endodormancy in sweet cherry (Prunus avium L.). Trees – Structure and Function. , (2018).
- Fadón, E., Herrero, M., Rodrigo, J. Dormant flower buds actively accumulate starch over winter in sweet cherry. Frontiers in Plant Science. 9 (171), (2018).
- Loescher, W. H., Mccamant, T., Keller, J. D. Carbohydrate reserves, translocation and storage in woody plant roots. HortScience. 25 (3), 274-281 (1990).
- Hedhly, A., et al. Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development. Plant Physiology. , (2016).
- Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Herrero, M. Ovary starch reserves and flower development in apricot (Prunus armeniaca). Physiologia Plantarum. 108 (1), 35-41 (2000).
- Julian, C., Rodrigo, J., Herrero, M. Stamen development and winter dormancy in apricot (Prunus armeniaca). Annals of Botany. 108 (4), 617-625 (2011).
- Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Pistil starch reserves at anthesis correlate with final flower fate in avocado (Persea americana). PLoS One. 8 (10), e78467 (2013).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C. Quantification of starch in plant tissues. Nature Protocols. 1 (3), 1342-1345 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological Imaging Software Tools. Nature Methods. 9 (7), (2013).
- Rodrigo, J., Herrero, M. Influence of intraovular reserves on ovule fate in apricot (Prunus armeniaca L.). Sexual Plant Reproduction. 11, 86-93 (1998).
- Zhou, J., Spallek, T., Faulkner, C., Robatzek, S. CalloseMeasurer: A novel software solution to measure callose deposition and recognise spreading callose patterns. Plant Methods. 8 (1), (2012).
- Faulkner, C., et al. An automated quantitative image analysis tool for the identification of microtubule patterns in plants. Traffic. 18 (10), 683-693 (2017).
- Kuhn, B. F. Determination of starch in ovules of the sour cherry cv. "Stevnsbaer.". European Journal of Horticultural Science. 71 (3), 120-124 (2006).
- Johansen, D. A. . Plant microtechnique. , (1940).
- Ruzin, S. E. . Plant microtechnique and microscopy. , (1999).
- Rodrigo, J., Rivas, E., Herrero, M. Starch determination in plant tissues using a computerized image analysis system. Physiologia Plantarum. 99 (1), 105-110 (1997).
- Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Ovary starch reserves and pistil development in avocado (Persea americana). Physiologia Plantarum. 140 (4), 395-404 (2010).
- Suarez, C., Castro, A. J., Rapoport, H. F., Rodriguez-García, M. I. Morphological, histological and ultrastructural changes in the olive pistil during flowering. Sexual Plant Reproduction. 25, 133-146 (2012).
- Lang, G. A., Early, J. D., Martin, G. C., Darnell, R. L. Endodormancy, paradormancy, and ecodormancy – Physiological terminology and classification for dormancy research. HortScience. 22 (3), 371-377 (1987).
- Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount clearing and staining of arabidopsis flower organs and siliques. Journal of Visualized Experiments. 2018 (134), 1-10 (2018).
- Kaufmann, H., Blanke, M. Changes in carbohydrate levels and relative water content (RWC) to distinguish dormancy phases in sweet cherry. Journal of Plant Physiology. 218 (July), 1-5 (2017).
- Herrero, M., Dickinson, H. G. Pollen-pistil incompatibility in Petunia hybrida: changes in the pistil following compatible and incompatible intraspecific crosses. Journal of Cell Science. 36, 1-18 (1979).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
