Her vil vi præsentere en metode til at isolere binyrerne fra mus, lave væv, afsnit dem og udføre immunofluorescens farvning.
Immunfluorescens er en veletableret teknik til påvisning af antigen i væv med beskæftigelse af fluorokrom-konjugerede antistoffer og har et bredt spektrum af programmer. Påvisning af antigener giver mulighed for karakterisering og identifikation af flere celletyper. Placeret over nyrerne og indkapslet af et lag af mesenchymale celler, er binyrerne en endokrine organ sammensat af to forskellige væv med forskellige embryologiske oprindelse, mesonephric mellemliggende mesoderm-afledte ydre cortex og de neurale Crest-afledte inderste medulla. Binyrebarken udskiller steroider (dvs., mineralkortikoider, glukokortikoider, kønshormoner), der henviser til, at adrenal medulla producerer katekolaminer (dvs., adrenalin, noradrenalin). Mens adrenal forsker, er det vigtigt at kunne skelne unikke celler med forskellige funktioner. Her giver vi en protokol udviklet i vores laboratorium, der beskriver en række sekventielle trin, der kræves for at opnå immunofluorescens farvning at karakterisere celletyper af binyrerne. Først fokuserer vi på dissektion af binyrerne mus mikroskopiske fjernelse af periadrenal fedt efterfulgt af fiksering, forarbejdning og paraffin indlejring af væv. Derefter beskriver vi, skæring af væv blokke med en Rotationsmikrotom. Endelig, vi detalje en protokol for immunfluorescent farvning af binyrerne, som vi har udviklet for at minimere både ikke-specifikke antistof bindende og autofluorescence for at opnå et optimalt signal.
Immunhistokemi er en teknik til at påvise væv komponenter med brug af antistoffer specifikke cellulære molekyler og efterfølgende farvning teknikker til at opdage den konjugerede antistoffer1. Denne immunhistokemiske procedure kræver specifikke fiksering og forarbejdning af væv, der bestemmes ofte empirisk for den specifikke antigen, væv og antistof udnyttet2. Fiksering er afgørende for at bevare den “oprindelige” tilstand af vævet og dermed bevare intakt cellulære og subcellulært strukturer og udtryk mønstre. Yderligere er forarbejdning og indlejring procedurer forpligtet til at forberede væv til skæring i tynde skiver, der bruges til histologiske undersøgelser der involverer Immunhistokemi.
Immunfarvning kan udføres med enten kromogent eller fluorescerende detektion. Kromogent påvisning kræver udnyttelsen af et enzym til at konvertere et opløseligt substrat til en uopløselig farvet produkt. Mens dette enzym kan være konjugeret til antistof anerkende antigen (primære antistof), er det oftere konjugeret til antistof erkendelse af det primære antistof (dvs., de sekundær antistof). Denne teknik er meget følsomt; farvede produktet som følge af enzymatisk reaktion er photostable og kræver kun en brightfield mikroskop til billedbehandling. Dog kan kromogent immunfarvning ikke være egnet, når de forsøger at visualisere to proteiner, der co Lokaliser, da aflejring af én farve kan maskere deposition af den anden. For Co farvning, immunofluorescens har vist sig for at være mere fordelagtig. Fremkomsten af immunofluorescens tilskrives Albert Coons og kolleger, der har udviklet et system til at identificere væv antigener med antistoffer markeret med fluorescein og visualisere dem i sektioneret væv under ultraviolet lys3. Registrering af Fluorescens er baseret på et antistof konjugeret med et fluorophore, der udsender lys efter excitation. Fordi der er flere fluorophores med emissioner på forskellige bølgelængder (med ingen eller lille overlapning), er denne metode til påvisning ideelt for studier af flere proteiner.
Binyrerne er et parret organ placeret over nyrerne og karakteriseret ved to embryologically særskilte komponenter omgivet af en mesenchymale kapsel. Ydre binyrebarken, afledt af mesonephric mellemliggende mesoderm, udskiller steroidhormoner, mens den inderste medulla, afledt af neurale crest, producerer katekolaminer, herunder adrenalin, noradrenalin og dopamin. I binyrebarken er histologisk og funktionelt opdelt i tre koncentriske zoner, med hver zone secernerende forskellige klasser af steroid hormoner: ydre zona glomerulosa (zG) producerer mineralkortikoider, der regulerer elektrolytten homøostase og intravaskulær volumen; den midterste zona fasciculata (zF), udskiller direkte under zG, glukokortikoider, der mægle stressrespons gennem mobilisering af energi butikker at øge plasma glukose; og de indre zona reticularis (zR), som syntetiserer sex steroid prækursorer (dvs., dehydroepiandrosterone (DHEAS))4.
Nogle variation i binyrebarkhormon zonation er til stede mellem arter: for eksempel, Mus musculus mangler zR. Den unikke postnatal X-zone af M. musculus er en rest af føtal cortex karakteriseret ved små lipid-fattige celler med acidophilic cytoplasms5. X-zone forsvinder i puberteten i mandlige mus og efter den første graviditet i hunmus eller degenererer gradvist i ikke-opdrættet hunner6,7. Desuden markeret tortuosity og tykkelse af zG udstiller variation mellem arter, som gør organisationen af perifere stamceller og stamfader celler i og støder op til zG. Rotte, i modsætning til andre gnavere, har en synlig udifferentierede zone (zU) mellem zG og zF der fungerer som en stamcelle zone og/eller en zone af forbigående forstærke stamfaderen. Om zU er unikke for rotter eller blot en mere prominently arrangeret klynge af celler er ukendt8,9.
Celler af binyrebarken indeholder lipid dråber, der gemmer kolesterol estere, der tjener som en forløber for alle steroidhormoner10,11. Udtrykket “steroidogenesis” definerer processen med produktion af steroidhormoner fra kolesterol via en serie af enzymatiske reaktioner, der involverer aktiviteten af steroidogene faktor 1 (SF1), hvis udtrykket er en markør for steroidogene potentiale. I binyrerne findes Sf1 udtryk kun i cellerne i cortex12. En interessant undersøgelse fundet udtryk af endogent biotin i binyrebarkhormon celler med steroidogene potentielle13. Mens dette kan være årsag til en højere baggrund i biotin/streptavidin-baserede farvnings-metoder, på grund af påvisning af endogent biotin af antistof konjugeret med streptavidin, kunne denne egenskab anvendes også til at skelne mellem den steroidogene celler fra andre befolkninger i binyrerne, dvs, endotel, kapsulær, og medulla celler.
Innerveres af sympatiske preganglionic neuroner, er binyremarven karakteriseret af baserig celler med en granuleret cytoplasma, der indeholder adrenalin og noradrenalin. Medulla celler er opkaldt “chromaffin” på grund af det høje indhold af katekolaminer, der danner en brun pigment efter oxidation14. Tyrosin hydroxylase (TH) er det enzym, der katalyserer den trafikhastighedsbegrænsning trin i syntesen af katekolaminer og i binyrerne, angives kun i medulla15.
Her præsenterer vi en protokol til isolering af musen binyrerne, deres forarbejdning til indlejring i paraffin og skæring, og en metode til at udføre immunofluorescens farvning på adrenal sektioner for at identificere de cellulære typer, der udgør den adrenal cortex og medulla. Denne protokol er en standard i vores laboratorium for immunfarvning med flere antistoffer rutinemæssigt anvendes i vores forskning.
Denne protokol beskriver en metode til isolering af musen binyrerne sammen med udarbejdelsen og farvning af sektioneret paraffin-embedded mus binyrer.
I forhold til andre protokoller, vi testede, bevist protokollens immunofluorescens egnet til fleste af antistoffer bruges i vores laboratorium. Det kan dog i visse tilfælde kræve nogle justeringer til at forbedre farvning resultaterne. En variabel, der kan nemt redigeres og testet er længden af fiksering. I vores laboratorium, inkubation i 4%…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Mohamad Zubair for hans nyttige forslag og teknisk bistand ved oprettelsen af denne protokol. Dette arbejde blev støttet af nationale Institut for Diabetes og Digestive og nyresygdomme, nationale institutter for sundhed Research Grant 2R01-DK062027 (til G.D.H).
24-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co. | 0412B | |
Disposable needles 25Gx5/8" | Exel International | 26403 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Paraplast plus | McCormik scientific | 39502004 | Paraffin for tissue embedding |
Shandon biopsy cassettes II with attached lid | Thermo scientific | 1001097 | Cassettes for tissue processing |
High Profile Microtome Blades | Accu-Edge | 4685 | Disposable stainless steel blades |
Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds | Polysciences Inc. | 18986 | Truncated,22mm square top tapered to 12mm bottom |
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | 75x25x1 mm |
Xylene | Fisher Chemical | X5P1GAL | |
200 Proof Ethanol | Decon Labs, Inc. | ||
Certi-Pad Gauze pads | Certified Safety Mfg, Inc | 231-210 | 3"x3. Sterile latex free gauze pads |
M.O.M kit | Vector laboratories | BMK-2202 | For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue |
KimWipes | Kimtech | 34155 | Wipes 4.4×8.4 inch |
Super PAP PEN | Invitrogen | 00-8899 | Pen to draw on slides |
Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544-D | Size: 22x50x1.5 |
DAPI | Sigma | D9542 | (Prepared in 20mg/mL stock) |
ProLong Gold antifade reagent | Molecular Probes | P36930 | Mounting agent for immunofluorescence |
X-cite series 120Q | Lumen Dynamics | Light source | |
Coolsnap Myo | Photometrics | Camera | |
Optiphot-2 | Nikon | Microscope | |
microtome | Americal Optical | ||
Tissue embedder | Leica | EG1150 H | |
Tissue processor | Leica | ASP300S | |
Normal goat serum | Sigma | G9023 | |
Mouse anti-TH | Millipore | MAB318 | Primary antibody |
Rabbit anti-SF1 | Ab proteintech group (PTGlabs) | custom made | Primary antibody |
Alexa-488 Mouse IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Secondary antibody |
Dylight-549 Rabbit IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 111-505-003 | Secondary antibody |
Citrate acid anhydrous | Fisher Chemical | A940-500 | |
NIS-Elements Basic Research | Nikon | Software for imaging |