Isolering, fixering och immunofluorescens avbildning av mus binjurarna

Summary

Här presenterar vi en metod för att isolera binjurarna från möss, fixa vävnader, avsnitt dem och utföra immunofluorescens färgning.

Abstract

Immunofluorescens är en väl etablerad teknik för detektion av antigen i vävnader med anställning av fluorokrom-konjugerade antikroppar och har ett brett spektrum av applikationer. Påvisande av antigen tillåter för karakterisering och identifiering av flera celltyper. Ovanför njurarna och inkapslade av ett lager av mesenkymala celler, är binjuren ett endokrina organ som består av två olika vävnader med olika embryologiska ursprung, mesonephric intermediate mesoderm-derived yttre cortex och den neurala Crest-derived inre medulla. Binjurebarken utsöndrar steroider (dvs mineralkortikoider, glukokortikoider, könshormoner), medan binjuremärgen producerar katekolaminer (dvs, adrenalin, noradrenalin). Samtidigt bedriva adrenal forskning, är det viktigt att kunna skilja mellan unika celler med olika funktioner. Här tillhandahåller vi ett protokoll som utvecklats i vårt laboratorium som beskriver en serie sekventiella steg krävs för att få immunofluorescens färgning att karakterisera celltyper i binjuren. Vi fokuserar först på dissektion av mus binjurarna, mikroskopiska borttagande av periadrenal fett följt av fixering, bearbetning och paraffin inbäddning av vävnad. Sedan beskriver vi snittning av vävnad blocken med en roterande mikrotom. Slutligen, detalj vi ett protokoll för Immunofluorescerande färgning av binjurarna som vi har utvecklat för att minimera både icke-specifik antikropp bindande och autofluorescens för att uppnå en optimal signal.

Introduction

Immunhistokemi är en teknik för att upptäcka vävnad komponenter med hjälp av antikroppar mot specifika cellulära molekyler och efterföljande färgning tekniker för att upptäcka den konjugera antikroppar¹. Proceduren immunhistokemisk kräver specifika fixering och bearbetning av vävnader som bestäms ofta empiriskt för specifika antigenet, vävnad och antikropp används². Fixering är avgörande för att bevara det ”ursprungliga” tillståndet för vävnaden och därigenom bibehålla intakt cellulär och subcellulär strukturer och uttrycksmönster. Ytterligare krävs bearbetning och inbäddning förfaranden för att förbereda vävnaden för snittning i tunna skivor som används för histologiska studier med immunhistokemi.

Immunfärgning kan utföras med antingen kromogen eller fluorescerande upptäckt. Kromogen upptäckt kräver utnyttjandet av ett enzym att konvertera ett lösligt substrat i en olöslig färgade produkt. Medan detta enzym kan vara konjugerat med den antikropp som känner igen antigenet (primär antikropp), är det mer ofta konjugerat till antikroppen erkänner den primär antikroppen (dvs, den sekundära antikroppen). Denna teknik är mycket känsliga; färgade orsakats av den enzymatiska reaktionen är fotostabil och kräver endast ett brightfield Mikroskop för avbildning. Kromogen immunfärgning kan dock inte lämplig när man försöker visualisera två proteiner som tillsammans lokaliserar, eftersom nedfall av en färg kan maskera nedfall av annan. När det gäller samtidig färgning, har immunofluorescens visat sig vara mer fördelaktiga. Tillkomsten av immunofluorescens tillskrivs Albert Coons och kollegor, som utvecklat ett system för att identifiera vävnad antigener med antikroppar märkta med fluorescein och visualisera dem i sektionerad vävnader under ultraviolett ljus³. Fluorescens upptäckt är baserad på en antikropp konjugerat med en fluorophore som avger ljus efter magnetisering. Eftersom det finns flera fluorophores med utsläpp vid olika våglängder (med ingen eller liten överlappning), är denna detektionsmetod idealisk för studier av flera proteiner.

Binjuren är en Parade organ sitter ovanför njurarna och kännetecknas av två embryologically distinkta komponenter omgiven av en mesenkymala kapsel. Yttre binjurebarken, härrör från mesonephric intermediate mesoderm, utsöndrar steroidhormoner medan inre medulla, härrör från neural crest, producerar katekolaminer inklusive adrenalin, noradrenalin och dopamin. Binjurebarken är histologiskt och funktionellt uppdelad i tre koncentriska zoner, med varje zon som utsöndrar olika klasser av steroidhormoner: den yttre zona glomerulosa (zG) tillverkar mineralkortikoider som reglerar elektrolyter homeostas och intravaskulär volym; den mellersta zona fasciculata, zF, utsöndrar direkt under zG, glukokortikoider som medlar stress svar genom mobilisering av energidiversehandel att öka plasmaglukos; och de inre zona reticularis (zR), som syntetiserar kön steroid prekursorer (dvs dehydroepiandrosteron (DHEAS))⁴.

Viss variation i adrenokortikal Colouir finns mellan arter: exempelvis Mus musculus saknar zR. Unik födsel X-zonen av M. musculus är en kvarleva av fostrets cortex kännetecknas av små lipid-fattiga celler med acidofiler cytoplasms⁵. X-zonen försvinner vid puberteten hos hanmöss och efter den första graviditeten hos honmöss, eller urartar gradvis i inte-uppfödda honor^6,7. Dessutom märkt den tortuosity och tjocklek av zG utställningsföremålen variation mellan arter som gör organisationen av perifera stamceller och stamceller celler i och intill zG. Råtta, till skillnad från andra gnagare, har en synlig odifferentierade zon (zU) mellan zG och zF som fungerar som en stamcell zon eller en zon av övergående förstärkande stamfäder. Huruvida zU är unik för råttor eller helt enkelt en mer tydligt organiserade kluster av celler är okänd^8,9.

Celler i binjurebarken innehåller lipid droppar som lagra kolesterol estrar som fungerar som föregångare till alla steroidhormoner^10,11.  Termen ”Steroidsyntes” definierar processen för produktion av steroidhormoner från kolesterol via en serie enzymatiska reaktioner som involverar aktiviteten av steroidogena faktor 1 (SF1), vars uttryck är en markör för steroidogena potential. I binjuren förekommer Sf1 uttryck endast i celler i cortex¹². En intressant studie hittade uttrycket av endogena biotin i adrenokortikal celler med steroidogena potentiella¹³. Medan detta kan vara orsaken till en högre bakgrund i biotin/streptividin-baserade färgning metoder, på grund av upptäckten av endogena biotin av antikropp konjugerat med streptividin, kunde detta kännetecken också användas för att skilja de steroidogena celler från andra populationer inom binjuren, dvs endothelial, kapsulära och märgen celler.

Binjuremärgen är innerveras av sympatiska preganglionära nervceller, och kännetecknas av basofila celler med ett granulat cytoplasman innehåller adrenalin och noradrenalin. Märgen celler namnges ”chromaffin” på grund av det höga innehållet av katekolaminer som bildar ett brunt pigment efter oxidation¹⁴. Tyrosin hydroxylas (TH) är det enzym som katalyserar det hastighetsbegränsande steget i syntesen av katekolaminer och i binjuren, uttrycks endast i medulla¹⁵.

Här presenterar vi ett protokoll för isolering av mus binjurarna, deras bearbetning för ingjutning i paraffin och snittning, och en metod att utföra immunofluorescens färgning på adrenal sektioner för att identifiera cellulära typer som utgör den adrenal cortex och medulla. Detta protokoll är en standard i vårt laboratorium för immunfärgning med flera antikroppar som rutinmässigt används i vår forskning.

Protocol

Alla metoder har utförts i enlighet med institutionellt godkända protokoll under auspicen av universitet utskottet för användning och skötsel av djur vid University of Michigan. 1. förberedelser inför kirurgi Dagen före operationen, förbereda 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) / fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Händelse av frysta portioner, Fortsätt att Tina en och förvaras vid 4 ° C.Obs: 4% PFA är inte stabila i mer än 48 h.FÖRSIKTIGHET: PFA är giftiga, Undvik kontak…

Representative Results

Figur 1 representerar en schematisk av hela protokollet beskrivs ovan. Binjurarna skördas från möss, intilliggande fettvävnad tas bort under en dissekera Mikroskop och adrenal korrigeras sedan i 4% PFA. Efter detta steg, binjurar bearbetas och inbäddade i paraffin, och sektioneras med en mikrotom skär orgeln i tunna skivor som deponeras på objektglas. Efter torkning av avsnitten, immunofluorescens utförs och avsnitten är avbildade på mikroskopet.</p…

Discussion

Det här protokollet beskriver en metod för isolering av mus binjurarna tillsammans med beredning och färgning av sektionerad paraffin-inbäddat mus binjurar.

Jämfört med andra protokoll som vi testade, immunofluorescens protokollet har visat sig lämplig för majoriteten av antikroppar används i vårt laboratorium. I vissa fall kan det dock kräva vissa justeringar förbättra färgning resultaten. En variabel som kan enkelt ändras och testade är längden av fixering. I vårt laborator…

Materials

24-well cell culture plate	Nest Biotechnology Co.	0412B
Disposable needles 25Gx5/8"	Exel International	26403
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148
Paraplast plus	McCormik scientific	39502004	Paraffin for tissue embedding
Shandon biopsy cassettes II with attached lid	Thermo scientific	1001097	Cassettes for tissue processing
High Profile Microtome Blades	Accu-Edge	4685	Disposable stainless steel blades
Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds	Polysciences Inc.	18986	Truncated,22mm square top tapered to 12mm bottom
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15	75x25x1 mm
Xylene	Fisher Chemical	X5P1GAL
200 Proof Ethanol	Decon Labs, Inc.
Certi-Pad Gauze pads	Certified Safety Mfg, Inc	231-210	3"x3. Sterile latex free gauze pads
M.O.M kit	Vector laboratories	BMK-2202	For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue
KimWipes	Kimtech	34155	Wipes 4.4×8.4 inch
Super PAP PEN	Invitrogen	00-8899	Pen to draw on slides
Microscope cover glass	Fisherbrand	12-544-D	Size: 22x50x1.5
DAPI	Sigma	D9542	(Prepared in 20mg/mL stock)
ProLong Gold antifade reagent	Molecular Probes	P36930	Mounting agent for immunofluorescence
X-cite series 120Q	Lumen Dynamics		Light source
Coolsnap Myo	Photometrics		Camera
Optiphot-2	Nikon		Microscope
microtome	Americal Optical
Tissue embedder	Leica	EG1150 H
Tissue processor	Leica	ASP300S
Normal goat serum	Sigma	G9023
Mouse anti-TH	Millipore	MAB318	Primary antibody
Rabbit anti-SF1	Ab proteintech group (PTGlabs)	custom made	Primary antibody
Alexa-488 Mouse IgG  raised goat	Jackson ImmunoResearch	115-545-003	Secondary antibody
Dylight-549 Rabbit IgG raised goat	Jackson ImmunoResearch	111-505-003	Secondary antibody
Citrate acid anhydrous	Fisher Chemical	A940-500
NIS-Elements Basic Research	Nikon		Software for imaging