Här presenterar vi en beprövad och testad protokoll för rening av kloroplast import proteinkomplex (TOC-TIC komplex) med TAP-taggen. One-step affinitet-isolering protokollet kan potentiellt tillämpas på något protein och används för att identifiera nya interaktion partners masspektrometri.
Kloroplast biogenes kräver import av tusentals nucleus-kodade proteinerna i plastid. Import av dessa proteiner är beroende av translocon vid yttre (TOC) och inre (TIC) kloroplast membran. TOC och TIC komplexen är multimeric och innehåller förmodligen ännu okända komponenter. En av de viktigaste målen i fältet är att etablera en komplett inventering av TOC och TIC komponenter. För isolering av TOC-TIC komplex och identifiering av nya komponenter modifierade preprotein receptorn TOC159 har varit N-terminalt genom tillsats av taggen tandem affinitet rening (TAP) vilket resulterar i TAP-TOC159. TAP-etiketten är utformad för två sekventiella affinitet reningssteg (därav ”tandem affinity”). TAP-etiketten används i dessa studier består av en N-terminal IgG-bindande domän härrör från Staphylococcus aureus Protein en (ProtA) följt av en calmodulin-bindande peptid (CBP). Mellan dessa två affinitet taggar, etch en tobak virus (TEV) proteas klyvning webbplats har inkluderats. TEV proteas kan därför användas för skonsam eluering av TOC159-innehållande komplex efter bindning till IgG pärlor. I protokollet presenteras här, utelämnades den andra Calmodulin affinitet reningssteg. Rening protokollet börjar med förberedelser och lösbarhet av totala cellulära membran. Efter tvättmedel-behandlingen inkuberas de solubilized membranproteiner med IgG pärlor för immunoisolation av tryck-TOC159-innehållande komplex. Vid bindning och omfattande tvätt, är TAP-TOC159 som innehåller komplex klyvs och släppt från IgG pärlorna använder den TEV proteas whereby S. aureus IgG-bindande domänen tas bort. Western blotting av den isolerade TOC159-innehållande komplex kan användas för att bekräfta förekomsten av känd eller misstänkt TOC och TIC proteiner. Viktigare, har TOC159-innehållande komplexen använts framgångsrikt att identifiera nya komponenter av TOC och TIC komplexen av masspektrometri. Det protokoll som vi presenterar potentiellt tillåter effektiv isolering av något membran-bundna protein komplex som ska användas för identifiering av ännu okänd komponenter av masspektrometri.
Växter är beroende av kloroplaster för fotosyntesen och photoautotrophic tillväxt1. Majoriteten av kloroplast proteinerna kodas i kärnan, syntetiseras i cytosolen och importeras till kloroplast via TIC och TOC komplexen i kuvert membran2. Kärnan i Innehållsförteckningen komplex består av Toc75 protein-ledande kanalen och två receptor GTPases Toc33 och Toc1593,4,5. TOC159 är viktigt för biogenes av kloroplaster och förmedlar massiv ackumulering av fotosyntes-associerade proteiner6. TIC anläggningen består av de TIC20 protein-bedriver kanal samt TIC110 och TIC407,8. Nyligen en 1MD protein flyttning komplexa på Innerkuvertet membranet var isolerad och innehöll tidigare oidentifierade komponenter9, varav den ena var TIC56. Vi isolerade nyligen Co TIC56 av 1 MDa komplexa använda protokollet TAP-TOC159 affinitet rening. Uppgifterna visade en strukturell överlappning mellan de ”kanoniska” TOC/TIC-komplex och 1 MDa komplexa10. Tidigare identifierades okända komponenter såsom KOC1 också som nya interaktion partners av TOC och TIC komplex med TAP-metoden beskrivs här10,11.
Således, TAP-tag rening är en effektiv metod för isolering av proteinkomplex och identifiering av samverkande partner med efterföljande massa spektrometriska analys12. Tryck på etiketten består av två IgG bindande repetitioner skild från en calmodulin-bindande peptid (CBP) av en tobak etch virus (TEV) proteas klyvning webbplats. Den ursprungliga metoden, bestående av en IgG-affinitet reningssteg följt av TEV klyvning och efterföljande calmodulin-affinitetskromatografi tillåtna infödda rening av stora och mycket ren protein komplex13,14 . Vi har förenklat förfarandet och visat att de TOC159-innehållande proteinkomplex också kan renas effektivt använder bara IgG-affinitet rening steget följt av TEV-klyvning för eluering15. Vår erfarenhet utelämnandet av steget calmodulin affinitet resulterade i högre avkastning och kan därför vara lämplig för låga överflöd proteiner.
Kort sagt, vi konstruerat stabil transgena A. thaliana rader uttrycka TAP-TOC159 i de ppi2 (toc159 KO mutant) bakgrund och etablerade den som en tillförlitlig källa för rening av TOC-TIC komplex. Protokollet för isolering av TOC-TIC anläggningen börjar med homogenisering av växtmaterial i en tvättmedel-fri buffert. Efter centrifugering kastas supernatanten. Den pellets som innehåller den totala membran fraktionen är solubilized använda ett tvättmedel som innehåller buffert. Efter en ultra-centrifugeringssteget tillämpas supernatanten innehållande solubilized TOC-TIC komplex IgG-kådan för affinitet rening. Efter flera tvättar steg, eluering utförs med en TEV proteas-innehållande buffert selektivt klyva nedströms av IgG-bindande domänerna och försiktigt släppa infödda TOC159-innehållande komplex. TEV eluatet kan analyseras direkt av Western blotting eller masspektrometri att identifiera den interaktiv partners TOC15910,11,15. Metoden har även använts för att identifiera post-translationella modifieringar av TOC15915. Infödda TOC159-innehållande komplex kan i framtiden användas för strukturella studier med cryoelectron mikroskopi.
Vi visade att ett enda steg tryck etiketten rening är en specifik och effektiv metod för rening av komplexet Arabidopsis TOC-TIC. Även om TAP-etiketten skulle tillåta två efterföljande reningssteg (IgG-följt av calmodulin affinitet rening efter TEV proteas-klyvning), anser vi att i många fall det första affinity steget följt av TEV proteas klyvning kommer att räcka. Vårt mål, TOC159, är låg rikligt och införandet av det andra calmodulin affinity steget överdrivet minskat protein avkastningen vilket var huvudskälet till att undanta den från vårt nuvarande protokoll. I TEV-eluering i sig är en mycket specifik och skonsam reningssteg som vilja bara frige TAP-taggade målet tillsammans med associerade interaktion partners medan kontaminerande proteinerna sticker icke-specifikt till IgG harts kommer att förbli där. Således, i kombination med IgG-affinitet steg, den TEV elueringen resulterar i en tillräckligt effektiv rening för våra och förmodligen många andra ändamål.
Vara måste försiktig att den TAP-taggade konstruktionen är fullt fungerande i vivo. TAP-taggning kan ha potentiellt skadliga effekter på proteinaktiviteten, stabilitet eller lokalisering. TOC159 består av tre domäner, N-terminala sura domänen, den centrala GTP-bindande domän och C-terminal membran domän, som förankrar TOC159 i yttre kloroplast membran2. För att undvika potentiella störningar med membran införande, smält vi TAP-taggen för att N-terminalen av TOC159. Fusion till N-terminalen är snarare undantag än regel. Många proteiner innehåller N-terminala målobjektet information och bör därför av etiketten på C-terminus. Vi säker på att TOC159 är funktionella i vivo genom komplettering av ppi2 mutant (en albino-muterat saknas TOC159) med tryck-TOC159. Räddning av green vildtyps fenotypen angav att TAP-TOC159 var funktionella15.
Rening protokollet användes för att identifiera nya interaktion partners av TOC159, som inkluderade KOC1 och TIC5610,11. Totalt var cirka 30 proteiner associerade med komplexet vilket tyder på att nya interaktion partners kommer att isoleras och kännetecknas i en nära framtid. Medan vi rekommenderar TAP-taggen för komplexa rening, skulle vi fortfarande vilja påpeka att ytterligare versioner den som presenteras här finns och kan vara mycket användbart för vissa program.
The authors have nothing to disclose.
Arbetet stöddes genom bidrag från schweiziska National Science Foundation (31003A_156998 och 31003A_176191) och universitetet i Neuchâtel.
NaHCO3 | PanReac AppliChem | A0384 | |
Tris | Biosolve | 0020092391BS | |
Na2HPO4 | Sigma | S7909 | |
KH2PO4 | PanReac AppliChem | A2946 | |
NaCl | PanReac AppliChem | A2942 | |
NaF | Sigma | S1509 | Toxic |
PMSF | PanReac AppliChem | A0999 | Toxic |
Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | |
Glycerol | PanReac AppliChem | A0970 | |
Triton X100 | Roche | 10789704001 | |
Glycine | PanReac AppliChem | A1067 | |
EDTA | Carl Roth | 8043 | |
Dithiothreitol (DTT) | PanReac AppliChem | A1101 | |
SDS | PanReac AppliChem | A0675 | |
Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
HCl | VWR | 20252-290 | Corrosive |
Sucrose | PanReac AppliChem | A3935 | |
Murashige and Skoog medium with vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
Phytoagar | Duchefa Biochemie | P1003 | |
Petri plate | Greiner Bio-one | 639102 | |
1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706 | |
Ethanol | Fisher chemical | E/0600DF/15 | |
Filter paper | Whatman | 10311804 | |
Surgical tape | 3M | 1530-1 | |
CNBr-Activated agarose beads (sepharose 4B) | GE Healthcare | 17-0430-01 | |
Sintered glass filter | DURAN | 2515703 | |
Centrifuge tube 50 mL | TPP | 91050 | |
Purified immunoglobulin G (HsIgG) | MP Biomedicals | 855908 | |
Rotating shaker | IKA | 4016000 | |
NaN3 (sodium azide) | Sigma | 71290 | Toxic |
Quick filtration material (Miracloth) | Merk-Millipore | 475855 | |
Ultracentrifube XNP-80 | Beckman Coulter | A99839 | |
Rotor SW 32 Ti | Beckman Coulter | 369650 | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
Glass teflon homogenizer (Potter) | Wheaton | 357426 | |
Spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M1003 | |
Filter 35µm for spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M513515 | |
AcTEV | Invitrogen | 12575-015 | |
Centrifugal evaporator (Speed Vac) | Eppendorf | 5305000100 | |
FBN1A(PGL35) antibody | AgriSera | AS06 116 | RRID:AB_2247012 |
Sand, Fontainebleau | VWR | 27460.295 |