Burada protein alma kompleksleri (TOC-TIC kompleksi) dokunun etiketini kullanarak kloroplast arıtma için kanıtlanmış ve test iletişim kuralı mevcut. Tek benzeşimi yalıtım Protokolü potansiyel olarak herhangi bir protein için uygulanabilir ve kütle spektrometresi ile yeni etkileşim ortaklar tanımlamak için kullanılan.
Kloroplast Biyogenez Plastit alma çekirdeği kodlu proteinleri binlerce gerektirir. Bu proteinler ithalat dış (TOC) ve iç (TIC) kloroplast membranlar translocon bağlıdır. İçindekiler tablosu ve TIC kompleksleri multimeric yüklenir ve muhtemelen henüz bilinmeyen bileşenleri içerir. TOC ve TIC bileşenleri tam envanter alanında ana amaçlarından biri kurmaktır. TOC-TIC kompleksleri yalıtım ve yeni bileşenleri tanımlaması için TOC159 oldu preprotein reseptör N-ölümcül musluk-TOC159 sonuçlanan tandem benzeşme arıtma (TAP) etiket eklenmesi tarafından değiştirildi. MUSLUK-etiket iki sıralı benzeşme arıtma adımları için tasarlanmıştır (dolayısıyla “tandem benzeşme”). Bu çalışmalarda kullanılan musluk-etiket (ProtA) takip Staphylococcus aureus Protein calmodulin bağlama peptid (CBP) tarafından türetilmiş bir N-terminal IgG-bağlayıcı etki oluşur. Bu iki benzeşme etiketleri arasında bir tütün etch virüs (TEV) proteaz bölünme site dahil olmuştur. Bu nedenle, TEV proteaz TOC159 içeren kompleksleri nazik elüsyon sonra IgG boncuk bağlama için kullanılabilir. Burada sunulan iletişim kuralında, ikinci Calmodulin-benzeşme arıtma adım ihmal. Arıtma Protokolü hazırlama ve toplam hücresel zarları solubilization ile başlar. Deterjan-tedaviden sonra çözündürüldükten membran proteinlerinin kompleksleri dokunun TOC159 içeren immunoisolation IgG boncuk ile inkübe. Bağlama ve geniş çamaşır üzerine, musluk-TOC159 içeren kompleksleri i ciddi ve IgG boncuk sayede S. aureus IgG-bağlayıcı etki kaldırılır TEV proteaz kullanarak serbest. Batı izole kurutma TOC159 içeren kompleksleri bilinen veya şüphelenilen TOC ve TIC proteinler varlığını doğrulamak için kullanılabilir. Daha da önemlisi, TOC159 içeren konut projeleri başarıyla TOC ve TIC kompleksleri yeni bileşenlerini belirlemek için kütle spektrometresi tarafından kullanılmaktadır. Biz potansiyel olarak mevcut iletişim kuralı herhangi bir membran bağlı protein verimli yalıtım karmaşık henüz bilinmeyen bileşenlerini tanımlanması için kütle spektrometresi tarafından kullanılmak üzere izin verir.
Bitkiler fotosentez ve photoautotrophic büyüme1kloroplast bağlıdır. Kloroplast proteinler büyük çoğunluğu çekirdeğinde kodlanmış, sitozol sentezlenmiş ve kloroplast zarf membranlar2TIC ve TOC kompleksleri ile içe aktarılmış. TOC karmaşık çekirdek protein iletken Toc75 kanal ve iki reseptör GTPases Toc33 ve Toc1593,4,5oluşur. TOC159 kloroplast Dipnotlar için önemlidir ve fotosentez ilişkili proteinler6büyük birikimi aracılık eder. TIC karmaşık TIC20 protein-iletken kanal yanı sıra7,8TIC110 ve TIC40 oluşur. Son zamanlarda, bir 1MD protein translocation iç zarf membran karmaşık izole edildi ve evvelce tanımlanamayan bileşenleri9hangi TIC56 biriydi, yer. Son zamanlarda ortak 1 MDa musluk-TOC159 benzeşme arıtma protokolünü kullanarak karmaşık TIC56 izole. Veriler “kanonik” TOC/TIC kompleksleri ve 1 MDa karmaşık10arasında yapısal bir örtüşme göstermiştir. Daha önce dokunun yöntemini kullanarak içindekiler tablosu ve TIC kompleksleri yeni etkileşim ortaklarının10,11burada açıklandığı gibi KOC1 bilinmeyen bileşenleri de tespit edilmiştir.
Böylece, TAP-etiket arıtma protein kompleksleri yalıtım ve etkileşen ortakları tarafından sonraki kitle spektrometrik Analizi12tanımlaması için verimli bir yöntemdir. DOKUNUN etiketi iki oluşur bir calmodulin bağlama peptid (CBP) bir tütün tarafından ayrılmış IgG bağlama tekrarlar etch virüs (TEV) proteaz bölünme sitesi. Bir IgG-benzeşme arıtma aşamasında oluşan orijinal yöntemi TEV bölünme tarafından takip ve sonraki calmodulin-benzeşme Kromatografi büyük ve son derece saf protein kompleksleri13,14 yerel arıtma izin . Biz prosedürü basitleştirilmiş ve TOC159 içeren protein kompleksleri de verimli bir şekilde sadece elüsyon15için TEV-bölünme tarafından takip IgG-benzeşme arıtma adım kullanarak saf olduğunu gösterdi. Bizim deneyim, calmodulin-benzeşme adım ihmal daha yüksek verimleri sonuçlandı ve bu nedenle düşük bereket proteinler için uygun olabilir.
Kısacası, biz kararlı transgenik A. thaliana mühendislik musluk-TOC159 ppi2 içinde (toc159 KO mutant) ifade çizgileri arka plan ve TOC-TIC kompleksleri arıtma için güvenilir bir kaynak olarak kurmuş. TOC-TIC kompleks izolasyon için protokol bitki materyali deterjan-Alerjik arabellekte homojenizasyon başlar. Santrifüjü sonra süpernatant atılır. Toplam membran kesir içeren pelet deterjan içeren bir arabellek kullanarak çözündürüldükten. Bir ultra-Santrifüjü adımdan sonra IgG-reçine benzeşme arıtma çözündürüldükten TIC TOC kompleksleri içeren süpernatant uygulanır. Birkaç sonra adımları yıkama, elüsyon IgG bağlayıcı etki alanlarının ve yavaşça seçmeli olarak aşağı ayırmak için TEV proteaz içeren bir arabellek kullanarak gerçekleştirilir yerli TOC159 içeren kompleksleri yayın. TEV eluate doğrudan Western blot veya TOC15910,11,15etkileşim ortaklarının tanımlamak için kütle spektrometresi tarafından çözümlenebilir. Yöntem da TOC15915translasyonel modifikasyonlar tanımlamak için kullanılmıştır. Gelecekte, yerel TOC159 içeren kompleksleri Kriyoelektron mikroskopisi kullanılarak yapısal çalışmalar için kullanılır.
Tek adım dokunun etiketi arıtma Arabidopsis TOC-TIC kompleks arıtma belirli ve verimli bir yöntem olduğunu gösterdi. MUSLUK-etiket iki ardışık arıtma adım (IgG-calmodulin benzeşme arıtma TEV proteaz-bölünme sonra ardından) izin verecek olsa da, birçok durumda TEV proteaz bölünme tarafından takip ilk benzeşme adım yeterli olacağına inanıyoruz. Hedefimiz, TOC159, bol düşük ve ikinci calmodulin-benzeşme adım eklenmesi aşırı bizim mevcut iletişim kuralından dışlamak için ana sebebi protein verim azalmış olduğunu. TEV-elüsyon kendi içinde özellikle IgG reçine yapışmasını proteinler kirletici orada kalacaktır süre yalnızca ilişkili etkileşim ortakları ile birlikte dokunun öğesini hedef yayınlayacak bir son derece özel ve nazik arıtma adımdır. Böylece, IgG-benzeşme adım ile birlikte, bizim ve muhtemelen diğerleri amaçlar için yeterince verimli bir saflaştırma TEV elüsyon sonuçlanır.
DOKUNUN öğesini yapı tamamen işlevsel içinde vivoolduğunu bakım alınması gerekir. DOKUNUN etiketleme protein etkinlik, istikrar veya yerelleştirme potansiyel olarak zararlı etkileri olabilir. Üç etki alanı, N-terminal asidik etki alanı, merkezi GTP-bağlayıcı etki ve dış kloroplast membran2‘ TOC159 tutturur C-terminal membran etki alanı, TOC159 oluşur. Membran ekleme ile potansiyel bir girişimi engellemek için musluk-etiket TOC159, N-terminus için erimiş. N-terminus Fusion daha doğrusu kural daha istisnadır. Çoğu protein N-terminal hedefleme bilgisini içeren ve bu nedenle tarafından etiketli C-terminus adlı. Biz TOC159 işlevsel vivo uluslara ppi2 mutant (bir albino mutant TOC159 eksik) tarafından musluk-TOC159 ile güvence verdi. Yeşil kurtarma, vahşi türü fenotip musluk-TOC159 fonksiyonel15olduğunu ima etti.
TOC159, KOC1 ve TIC5610,11dahil yeni etkileşim ortaklarının tanımlamak için kullanılan arıtma protokol. Toplamda, yaklaşık 30 proteinler bu yeni etkileşim ortakları izole ve yakın bir gelecekte karakterize düşündüren kompleksi ile ilişkili bulunmuştur. MUSLUK-etiket kompleksi arıtma öneririz iken, biz hala burada sunulan bir ek sürümleri var ve bazı uygulamalar için çok yararlı olabilir işaret etmek istiyorum.
The authors have nothing to disclose.
İş hibe İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (31003A_156998 ve 31003A_176191) ve Neuchâtel Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.
NaHCO3 | PanReac AppliChem | A0384 | |
Tris | Biosolve | 0020092391BS | |
Na2HPO4 | Sigma | S7909 | |
KH2PO4 | PanReac AppliChem | A2946 | |
NaCl | PanReac AppliChem | A2942 | |
NaF | Sigma | S1509 | Toxic |
PMSF | PanReac AppliChem | A0999 | Toxic |
Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | |
Glycerol | PanReac AppliChem | A0970 | |
Triton X100 | Roche | 10789704001 | |
Glycine | PanReac AppliChem | A1067 | |
EDTA | Carl Roth | 8043 | |
Dithiothreitol (DTT) | PanReac AppliChem | A1101 | |
SDS | PanReac AppliChem | A0675 | |
Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
HCl | VWR | 20252-290 | Corrosive |
Sucrose | PanReac AppliChem | A3935 | |
Murashige and Skoog medium with vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
Phytoagar | Duchefa Biochemie | P1003 | |
Petri plate | Greiner Bio-one | 639102 | |
1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706 | |
Ethanol | Fisher chemical | E/0600DF/15 | |
Filter paper | Whatman | 10311804 | |
Surgical tape | 3M | 1530-1 | |
CNBr-Activated agarose beads (sepharose 4B) | GE Healthcare | 17-0430-01 | |
Sintered glass filter | DURAN | 2515703 | |
Centrifuge tube 50 mL | TPP | 91050 | |
Purified immunoglobulin G (HsIgG) | MP Biomedicals | 855908 | |
Rotating shaker | IKA | 4016000 | |
NaN3 (sodium azide) | Sigma | 71290 | Toxic |
Quick filtration material (Miracloth) | Merk-Millipore | 475855 | |
Ultracentrifube XNP-80 | Beckman Coulter | A99839 | |
Rotor SW 32 Ti | Beckman Coulter | 369650 | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
Glass teflon homogenizer (Potter) | Wheaton | 357426 | |
Spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M1003 | |
Filter 35µm for spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M513515 | |
AcTEV | Invitrogen | 12575-015 | |
Centrifugal evaporator (Speed Vac) | Eppendorf | 5305000100 | |
FBN1A(PGL35) antibody | AgriSera | AS06 116 | RRID:AB_2247012 |
Sand, Fontainebleau | VWR | 27460.295 |