यहां, हम उत्पादन और स्थिर आइसोटोप के साथ लेबल कर रहे हैं कि प्रोटीन के शुद्धिकरण के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है, और प्रोटीन प्रोटीन बातचीत के बाद के लक्षण वर्णन परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी और अतिसूक्ष्म का उपयोग Thermophoresis (MST) उपाययोजना.
vimentin जैसे रेशा प्रोटीन साइटों के साथ एक संरचनात्मक पाड़ प्रदान करके कोशिकाओं के भीतर संगठन प्रदान करते है कि बांध प्रोटीन युक्त plakin दोहराता है । यहां, का पता लगाने और इस तरह के बातचीत को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल envoplakin के गोलाकार plakin दोहराने डोमेन और vimentin के पेचदार कुंडल का उपयोग कर वर्णन किया गया है । यह निर्धारित करने के लिए एक आधार प्रदान करता है कि क्या एक प्रोटीन बांधता vimentin (या समान रेशा प्रोटीन) और बातचीत के संबध की माप के लिए । ब्याज की गोलाकार प्रोटीन समाधान में vimentin प्रोटीन के साथ 15N और titrated के साथ लेबल है । एक दो आयामी एनएमआर स्पेक्ट्रम पीक आकार या रासायनिक बदलाव में परिवर्तन देख द्वारा बातचीत का पता लगाने के लिए अधिग्रहण कर लिया है, और नमक का स्तर, जो vimentin चतुर्धातुक संरचना प्रभाव सहित समाधान की स्थिति के प्रभाव स्पष्ट । यदि ब्याज का प्रोटीन रेशा ligand बाँधता है, तो बाध्यकारी संपर्क को शुद्ध प्रोटीन का प्रयोग करके MST से quantified जाता है. दृष्टिकोण का निर्धारण करने के लिए एक सीधा रास्ता है कि ब्याज की एक प्रोटीन एक रेशा बांध, और कैसे परिवर्तन, जैसे उत्परिवर्तनों या समाधान की स्थिति के रूप में, आकलन के लिए बातचीत को प्रभावित ।
प्रोटीन के बीच बातचीत आणविक मशीनों है कि कोशिकाओं के भीतर आदेश बनाने के गठन की अनुमति देते हैं । व्यक्तिगत बातचीत अक्सर कमजोर हैं, लेकिन आमतौर पर multivalent परिसरों कि सहकारी और गतिशील विनियमित किया जा सकता है के लिए योगदान । संवेदनशील परख है कि परमाणु संकल्प और इस तरह के जटिल बातचीत के बारे में मात्रात्मक जानकारी प्रदान deduce तंत्र और डिजाइन हस्तक्षेप जैसे दवा के अणुओं की तरह की जरूरत है । एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रोटीन बातचीत के बारे में इस तरह की जानकारी प्राप्त करने के लिए एक कुशल तरीका है, और भी उन है कि कमजोर1बांध सहित लाइगैंडों के लिए तेजी से स्क्रीनिंग के लिए प्रयोग किया जाता है । एनएमआर तरीकों का इस्तेमाल किया उन है कि प्रोटीन का पालन कर रहे है या ligand निरीक्षण में वर्गीकृत किया जा सकता है । इस पांडुलिपि पूर्व दृष्टिकोण का उपयोग करता है जिसमें एक स्पेक्ट्रम एक स्थिर-आइसोटोप लेबल प्रोटीन है कि अपेक्षाकृत छोटे है (आमतौर पर 20 केडीए के तहत) का अधिग्रहण किया है और unlabel titrated है । यह अनुकूल मामलों में मैप किया जा करने के लिए बातचीत में शामिल लेबल अवशेषों की अनुमति. एक बार जटिल रूपों, वहां के अवशेषों बातचीत के रासायनिक वातावरण में परिवर्तन कर रहे है कि खुद को रासायनिक बदलाव और उनके एनएमआर संकेतों के आकार में परिवर्तन के रूप में प्रकट । इस तरह के परिवर्तनों की सीमा बातचीत में इन समूहों की भागीदारी की डिग्री के साथ संबद्ध । रासायनिक बदलाव perturbations (CSPs) के अभाव और ligand की अलग मात्रा की उपस्थिति में एकत्र प्रोटीन की एनएमआर स्पेक्ट्रा की एक श्रृंखला की तुलना द्वारा मापा जा सकता है । बड़े लाइगैंडों या जटिल इंटरैक्शन के लिए, पीक आकार या तीव्रता में परिवर्तन को deduce इंटरैक्शन से मापा जा सकता है.
सबसे आम 2d प्रयोग ligand बातचीत का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया 15N-heteronuclear एकल क्वांटम सहसंबंध (HSQC) प्रयोग2है । यह आवश्यक है कि एक प्रोटीन समान रूप से 15n, जो आम तौर पर उंहें समानता के रूप में व्यक्त- ई. कोलाई बैक्टीरियल 15n-समृद्ध मीडिया में हो संस्कृतियों में संस्करणों टैग के साथ लेबल किया जाना चाहिए । बाध्यकारी जब HSQC स्पेक्ट्रा अनुमापन के दौरान एकत्र आरोपित रहे हैं स्पष्ट है, जटिल गठन में शामिल अवशेषों का एक सबसेट के लिए पीक परिवर्तन खुलासा. बातचीत तेजी से विनिमय शासन में हो सकता है जहां स्वतंत्र और ligand-संतृप्त राज्य संकेतों एक जनसंख्या औसत शिखर में गिर जाते हैं । वैकल्पिक रूप से, राज्यों के बीच धीमे विनिमय के मामले में, दोनों संकेतों को उनके सापेक्ष मात्रा का प्रतिनिधित्व करने वाले अभिंन के साथ मनाया जाता है । जबकि एनएमआर lineshape विश्लेषण कुछ मामलों में बाध्यकारी समानताएं अनुमान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, MST के रूप में तरीके भी सुविधाजनक साबित कर दिया है और वास्तविक बातचीत के पार मांयता प्रदान करते हैं ।
प्रदान की उदाहरण दो desmosomes के भीतर पाया प्रोटीन की है । वे सेल सतहों और cytoskeleton और मध्यस्थता त्वचा और दिल के ऊतकों की अखंडता को बनाए रखने और कतरनी बलों के झेलने के लिए सेल आसंजन मशीनों और मध्यवर्ती तंतुओं के बीच multivalent बातचीत के बीच जंक्शनों मध्यस्थता । रोग परिणाम कर सकते हैं जब desmosomal प्रोटीन जैसे desmoplakin या vimentin उत्परिवर्तनों या एंटीबॉडी से समझौता कर रहे हैं, सेल के स्थिरीकरण के लिए अग्रणी-सेल जंक्शनों, और इसलिए उनकी बातचीत महत्वपूर्ण महत्व के हैं3. desmosomal प्रोटीन द्वारा बाध्यकारी ligand का संरचनात्मक आधार एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा विशेषता हो सकता है, जबकि बातचीत quantified द्वारा MST किया जा सकता है । तरीकों के साथ साथ plakin दोहराने डोमेन (PRDs) है जो अक्सर साथ मिलकर सेट है कि बुनियादी खांचे, और vimentin, एक मध्यवर्ती रेशा है कि एक अंलीय अपनी पेचदार द्वारा की पेशकश की सतह के माध्यम से सूचना का आदान प्रदान के रूप में मौजूद है के बीच बातचीत की विशेषताएं थे बंडल4. इन परिसरों कोशिका झिल्ली जहां वे सेल cytoskeleton के मध्यवर्ती तंतु के लिए desmosomes कि आसंन कोशिकाओं से कनेक्ट करने के लिए लंगर का गठन कर रहे हैं, इस प्रकार एक ऊतक भर में radiates कि चिपकने वाला बांड का एक नेटवर्क बनाने ।
2d 15N-हल एनएमआर प्रयोग सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तरीकों में से एक को दिखाने के कैसे दो अणुओं बातचीत है । यह सबसे अधिक जानकारी संपंन तरीका है कि दोनों भागीदारों के संकेतों को लगातार समाधान राज्य में एक अनुमापन प्रयोग भर में निगरानी की अनुमति देता है । हालांकि आम तौर पर गुणात्मक बड़े परिसरों के मामले में, विधि भी अनुकूल मामलों में इस्तेमाल किया जा सकता है बाध्यकारी समानताएं जहां एनएमआर संकेत उच्च संकल्प स्पेक्ट्रा में ट्रैक किया जा सकता है मापने के लिए । जहां असाइनमेंट सुविधाजनक रूप से किए जा सकते हैं, जैसे कई प्रोटीन के मामले में 20 केडीए के तहत आकार में, बाध्यकारी साइटों को भी मैप किया जा सकता है. पूरक परख जैसे MST समाधान में बातचीत के बारे में मात्रात्मक जानकारी प्रदान करते हैं, और unlabel्ड राज्यों में कम प्रोटीन की आवश्यकता होती है । उत्परिवर्ती बाध्यकारी डेटा की तुलना नियंत्रण प्रदान करने के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए उपयोगी है कि बातचीत एनएमआर लाइन को विस्तृत करने का सबूत वास्तविक और नहीं कलाकृतियों, उदाहरण के लिए, एकत्रीकरण या चिपचिपापन परिवर्तन कर रहे हैं ।
प्रोटीन एक्सप्रेशन
अभिव्यक्ति प्रक्रिया को कारगर बनाने के श्रम गहन प्रोटीन उत्पादन की मात्रा कम कर देता है । इस अनुकूलन प्रक्रिया का हिस्सा प्रोटीन की रिकॉमबिनेंट अभिव्यक्ति के लिए ई. कोलाई का एक उचित तनाव की पहचान शामिल है । तनाव वरीयता उपयोग में वेक्टर की प्रकृति सहित तत्वों पर निर्भर करता है और, अधिक विशेष रूप से, रिकॉमबिनेंट प्रोटीन की अंतिम स्थिरता7व्यक्त की जा रही है । अंतर्जात ई. कोलाई द्वारा heterologous प्रोटीन के क्षरण के जोखिम को छेड़ने की कमी ई. कोलाई जैसे BL21 तनाव के उपयोग से कम किया जा सकता है । दुर्लभ codons युक्त जीन के लिए, BL21-CodonPlus (DE3) RIPL जैसे एक तनाव पसंद किया जा सकता है । इस तनाव arginine, isoleucine, के लिए दुर्लभ codon tRNAs की अतिरिक्त अंतर्जात प्रतियां के साथ BL21 तनाव की तंग कमी प्रकृति को जोड़ती है, रेखा, और leucine । वैकल्पिक रूप से, दुर्लभ codons कि स्पष्ट समझौता कर सकते हैं एक codon अनुकूलित एक वाणिज्यिक स्रोत से निर्माण के आदेश से बचा जा सकता है । ई. कोलाई के कई उपभेदों रिकॉमबिनेंट जीन अभिव्यक्ति के लिए उपलब्ध हैं, प्रत्येक7अभिव्यक्ति के दौरान एक विशेष समस्या के दरकिनार के लिए अनुकूलित । इस अध्ययन के मामले में, मानक की कमी तनाव BL21 (DE3) बाद की शुद्धि और विश्लेषण के लिए घुलनशील प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में उत्पादन किया ।
प्रोटीन शुद्धि
एक दिया प्रोटीन के लिए शुद्धि प्रोटोकॉल अक्सर अर्थ में अद्वितीय है कि प्रत्येक प्रोटीन स्थिर और घुलनशील जैसे तापमान, नमक एकाग्रता, या पीएच के रूप में विभिंन स्थितियों के अंतर्गत रहता है । अपनत्व क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से शुद्धिकरण का समग्र प्रभाव शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान विभिन्ना कदमों पर imidazole जैसे eluting प्रजातियों की एकाग्रता के प्रति भी संवेदनशील होता है. इस काम में, IMAC के लिए महत्वपूर्ण बफर शर्तों ई के लिए पीएच थे PRD, और VimRod के लिए imidazole एकाग्रता । ७.५ का एक पीएच IMAC कॉलम से ई-PRD निंनलिखित प्रारंभिक रेफरेंस के वर्षण से बचने के लिए आवश्यक था । VimRod के IMAC शुद्धि के लिए, स्तंभ वॉश कदम के दौरान 30 से ५० mM से imidazole की एकाग्रता में वृद्धि अंतिम रेफरेंस अंशों की शुद्धता में पर्याप्त सुधार करने के लिए पाया गया था । रेफरेंस स्टेप के लिए २५० से imidazole की एकाग्रता बढ़ाने से ३५० एमएम भी फाइनल रेफरेंस की उपज में सुधार पाया गया । elute २५० mM imidazole का उपयोग कर प्रोटीन के लिए प्रारंभिक प्रयास VimRod के अधूरा रेफरेंस के लिए नेतृत्व के रूप में कॉलम की एक अंतिम 1 मीटर imidazole पट्टी से पता चला (डेटा नहीं दिखाया गया है) । imidazole एकाग्रता को बढ़ाने के लिए ३५० mM के रेफरेंस के लिए पर्याप्त मात्रा में प्रोटीन से बंधे कॉलम को ठीक किया गया. एस एक दोहरे उद्देश्य की सेवा कर सकते है क्योंकि यह प्रोटीन शुद्धि के लिए एक चमकाने कदम के रूप में कार्य करता है जबकि एक साथ बफर एक्सचेंज प्रदर्शन । बफर एक्सचेंज बाद बाध्यकारी विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि यह elute His6-टैग प्रोटीन के लिए इस्तेमाल imidazole हटा । यह भी एक ऐसी नमक एकाग्रता या पीएच, जो कुछ बहाव तकनीकों या परख की प्रभावकारिता को प्रभावित कर सकते है के रूप में शर्तों को बदलने का अवसर के रूप में कार्य करता है । प्रोटीन थर्मल शिफ्ट (अंक), विशेष रूप से कमरे के तापमान8,9पर समय की लंबी अवधि के लिए स्थिर प्रोटीन की आवश्यकता होती है उन लोगों के लिए बहाव परख के लिए इष्टतम बफ़र्स की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
बाइंडिंग विश्लेषण
प्रोटीन है कि हौसले से तैयार है सही बाध्यकारी परख के लिए महत्वपूर्ण है, हालांकि जमे हुए प्रोटीन भी जब तक परिणाम की तुलना कर रहे है के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । एक नमक और पीएच निर्भर फैशन में vimentin multimerize जैसे रेशा प्रोटीन, और इसलिए समाधान हालत को अनुकूलित किया जा करने की आवश्यकता है और इस तरह धारा10,11, गतिशील प्रकाश बिखरने के रूप में एक विधि द्वारा अनुमानित oligomeric राज्य 12 या विश्लेषणात्मक ultracentrifugation13,14,15. एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी परमाणु संकल्प पर छोटे प्रोटीन की ligand बातचीत को मापने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है । हालांकि, जब एक प्रोटीन बड़ा अणु के साथ सूचना का आदान प्रदान, धीमी tumbling मग्न, और संकेतों की हानि में यह परिणाम है, जो बाध्यकारी पुष्टि कर सकते है हालांकि यह जरूरी बंधन साइटों, जो भी काम की आवश्यकता होगी के मानचित्रण की अनुमति नहीं है कम रीढ़ की अनुनादों. इस परिदृश्य में, एनएमआर प्रयोग सहभागिता साइट की पहचान की अनुमति नहीं देते । अतएव साइट निर्देशित mutagenesis को बाध्यकारी के लिए आवश्यक अवशेषों की पहचान करने के लिए लागू किया जाता है । इस तरह के म्यूटेंट इसलिए संकेत हानि प्रदर्शित नहीं करते । इस प्रोटोकॉल में, १९१४ की स्थिति पर एक प्रतिस्थापन के साथ एक उत्परिवर्ती फार्म VimRod की उपस्थिति में चोटी तीव्रता बरकरार रखती है और इसलिए ई की बातचीत के विघटन की पुष्टि PRD और VimRod । रीढ़ और sidechain अनुनादों के असाइनमेंट इस दृष्टिकोण के लिए मूल्य जोड़ना होगा, विशेष रूप से मुक्त ई के लिए संरचना के रूप में PRD एक्स द्वारा हल किया गया है-रे क्रि4। एनएमआर के भविष्य के अनुप्रयोगों के बड़े अणुओं के बीच जटिल बातचीत का लक्षण वर्णन शामिल है और अल्ट्रा उच्च क्षेत्र मैग्नेट और अन्य चौकस समूहों के उपयोग से इस तरह के रूप में 13ग लेबल और trifluoro मिथाइल समूहों के पत्रकारों के रूप में लाभ होगा ।
MST16बंधन बातचीत का अध्ययन करने के लिए लाभ के एक नंबर है । बाध्यकारी साझेदार समाधान में स्वतंत्र हैं और मैटीरियल नहीं है । नमूनों की गुणवत्ता का विश्लेषण, एकत्रीकरण की गुणवत्ता नियंत्रण रिपोर्टिंग, केशिकाओं के लिए सोखना या लक्ष्य अणु के अपर्याप्त फ्लोरोसेंट लेबलिंग के साथ सॉफ्टवेयर में बनाया गया है । लक्ष्य की छोटी मात्रा में आम तौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं, लेबल लक्ष्य की एकाग्रता एक 10-20 μL मात्रा में 20-50 एनएम के बीच आम तौर पर है/ इस प्रोटोकॉल बहुत छोटे प्रतिक्रिया संस्करणों का उपयोग करता है (10 μL) ligand की एकाग्रता को अधिकतम करने के लिए कि कमजोर बाध्यकारी बातचीत की अनुमति titrations में प्राप्त किया जा सकता है विशेषता है । यह आवश्यक सटीक pipetting और देखभाल बुलबुले शुरू करने से बचने के लिए लिया जा रहा है, जबकि अभी भी अच्छी तरह से मिश्रण । पर्याप्त मिश्रण धारावाहिक कमजोर पड़ने के सेट के साथ सटीक, लगातार प्रतिदीप्ति माप के लिए महत्वपूर्ण है । MST प्रयोगों में 20 के बीच की राशि एक मानक ०.०५% से ०.०१५% करने के लिए बुलबुले बनाने और मिश्रण में सुधार की प्रवृत्ति को कम किया गया था ।
लाल-Tris-ंत् डाई एक त्वरित, आसान और सुविधाजनक तरीका है फ्लोरोसेंट किसी भी प्रोटीन है कि एक अपने टैग है लेबल । लेबलिंग प्रभावी ढंग से केवल 30 मिनट में पूरा हो गया है और बहुत तंग है ताकि कोई डाई हटाने की प्रक्रिया आवश्यक है । कोई संशोधन प्रोटीन है कि ligand बाध्यकारी गुणों को बदल सकता है में एमिनो एसिड अवशेषों के लिए किए गए हैं । एक चेतावनी है कि केवल प्रोटीन एक His6 टैग होना चाहिए लेबल होना चाहिए । यह ligand प्रोटीन से टैग की दरार की आवश्यकता, e-PRD, और टैग को हटाने और एक दूसरे IMAC कॉलम कदम के साथ ई-PRD uncleav । यदि संभव हो, ligand प्रोटीन एक अपने टैग के उपयोग के बिना तैयार किया जाना चाहिए । वैकल्पिक रूप से, प्रोटीन covalently lysine अवशेषों या thiol युग्मन के लिए cysteine अवशेषों को अमीन युग्मन के माध्यम से एक fluorophore के साथ लेबल किया जा सकता है । हालांकि, देखभाल जब एक fluorophore के आबंध लगाव के बाद से ऐसी प्रणालियों का उपयोग कर लिया जाना चाहिए इलेक्ट्रोस्टैटिक या ध्रुवीय बाध्यकारी lysine या cysteine अवशेषों पर निर्भर बातचीत को प्रभावित कर सकते हैं । MST द्वारा VimRod और ई-PRD के बीच बाध्यकारी संबधों की ठहराव को असामान्य रूप से नमक एकाग्रता के प्रति संवेदनशील किया गया । इस समस्या को शुरू में dialyzing द्वारा दोनों लक्ष्य और ligand परख बफर के एक ही बैच में कम किया गया था । बहरहाल, MST बाध्यकारी वक्र के संतृप्ति प्राप्त नहीं किया जा सकता है जब १५० mM VimRod के जटिल व्यवहार के कारण NaCl की उपस्थिति में MST परख प्रदर्शन । विश्वसनीय, पूरा डेटा प्राप्त किया गया था एक बार NaCl की एकाग्रता के लिए कम किया गया था 10 मिमी सही गणना की अनुमति KD. इसलिए, समाधान की स्थिति और पूरक परख के साथ तुलना के सावधान अनुकूलन मजबूत परिणाम प्राप्त करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं । इसके अलावा, MST के लिए एक दिया बातचीत के लिए नमक निर्भरता यों तो इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रोटीन बातचीत के stoichiometric गुण यों तो, प्रोटीन तह की निगरानी, और एंजाइम कैनेटीक्स में जांच17।
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना NSERC RGPIN द्वारा समर्थित किया गया है-2018-04994, परिसर अलबर्टा नवाचार कार्यक्रम (आरसीपी-12-002C) और अलबर्टा Prion अनुसंधान संस्थान/अलबर्टा नवाचारों जैव समाधान (२०१६०००१८), एम ओ और जीनोम कनाडा और कनाडा फाउंडेशन के लिए संमानित किया Metabolomics इनोवेशन सेंटर (TMIC) तथा NANUC को नवाचार अनुदान प्रदान किया गया ।
Monolith NT.115, includes control and analysis software | NanoTemper Technologies | MO-G008 | Instrument for microscal thermophoresis |
His-Tag Labeling Kit RED-Tris-NTA | NanoTemper Technologies | MO-L008 | RED-tris-NTA dye for MST |
Standard capillaries | NanoTemper Technologies | MO-K022 | capillaries for MST |
HisTrap HP, 5 mL | GE Healthcare | 17524801 | IMAC column |
HisPur Ni-NTA resin, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 88222 | IMAC resin |
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare | 28989333 | SEC column |
TEV protease | Sigma Aldrich | T4455 | cleavage of his tag from E-PRD |
BL21(DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527H | cells for protein expression |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets EDTA-Free | Sigma Aldrich | 11873580001 | protease inhibitors for protein purification by IMAC |
TCEP, Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | reducing agent for protein purification |
Reagents (HEPES, NaCl, etc) | Sigma Aldrich | various | Preparation of media and buffers |
Ammonium chloride (15N, 99%) | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467 | isotope labelling for NMR |
D2O, Deuterium Oxide (D, 99.8%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2259 | NMR sample preparation |
DSS, Sodium 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-D6 (D,98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-8206 | reference for NMR |
Precision 5 mm NMR Tubes, 7” long | SJM/Deuterotubes | BOROECO-5-7 | NMR tubes |
NMR spectrometer (14.1 Tesla) | Bruker | acquisition of NMR data | |
TCI 5mm z-PFG cryogenic probe | Bruker | acquisition of NMR data | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Bruker TopSpin 4.0.1 | Bruker | processing of NMR data | |
MO.Control | NanoTemper Technologies | included with Monlith NT.115 | |
MO.Affinity Analysis | NanoTemper Technologies | included with Monlith NT.115 |