Her presenterer vi en protokoll for produksjon og rensing av proteiner som er merket med stabile isotoper og påfølgende karakteristikk av protein-protein interaksjoner ved hjelp av kjernefysiske magnetisk resonans (NRM) spektroskopi og Mikroskala Thermophoresis (MST) eksperimenter.
Trådformede proteiner som vimentin gir organisasjonen i celler ved å gi en strukturelle skafottet nettsteder som binder proteiner som inneholder plakin gjentas. Her, er en protokoll for å oppdage og måle slik interaksjon beskrevet ved hjelp av globular plakin gjenta domenet envoplakin og spiralformede spolen av vimentin. Dette gir et grunnlag for å bestemme om et protein som binder vimentin (eller lignende trådformede proteiner) og for måling av slektskap av samhandlingen. Globular protein av interesse er merket med 15N og titreres med vimentin protein i løsningen. En todimensjonal NMR spekter er kjøpt å oppdage interaksjoner ved å observere endringer i topp form eller kjemiske Skift og belyse virkningene av løsning betingelser inkludert salt nivåer, som påvirker vimentin kvartær struktur. Hvis protein rundt binder trådformede ligand kvantifisert binding samspillet ved MST bruker renset proteiner. Tilnærmingen er en grei måte å avgjøre om et protein rundt binder en filament og vurdere hvordan endringer, for eksempel mutasjoner eller løsning forhold, påvirke interaksjonen.
Interaksjoner mellom proteiner tillater dannelse av molekylære maskiner som oppretter rekkefølge i celler. Individuelle interaksjoner er ofte svake men vanligvis bidrar til multivalent komplekser som kan være samarbeidsvillig og dynamisk regulert. Følsom analyser som gir atomic oppløsning og kvantitativ informasjon om slike komplekse interaksjoner for å utlede mekanismer og design intervensjoner som narkotika-lignende molekyler. NMR spektroskopi er en effektiv metode for å få informasjon om protein interaksjoner, og også brukes for rask screening for ligander inkludert de som binder svakt1. NMR metodene som brukes kan kategoriseres i de som er protein observere eller ligand observere. Dette manuskriptet bruker tidligere tilnærming der et spekter av en stabil-isotop merket protein som er relativt liten (vanligvis under 20 kDa) er kjøpt og umerkede ligand titreres. Dette tillate merket rester fra samhandlingen kartlegges i fordelaktige tilfeller. Når de komplekse formene, det er endringer i kjemiske miljøer i samspill rester som manifesterer seg som endringer i kjemisk skiftet og form av deres NMR signaler. Omfanget av slike endringer korrelerer med graden av deltakelse av gruppene i samspillet. Kjemisk Skift forstyrrelser (CSP) kan måles ved å sammenligne en rekke NMR spekter av proteinet samlet i fravær og tilstedeværelsen av varierende mengder ligand. For større ligander eller komplekse interaksjoner, kan endringen i topp fasong eller intensiteten måles for å utlede interaksjoner.
Vanligste 2D eksperimentet brukes for å avdekke ligand interaksjoner er 15N-heteronuclear enkelt quantum sammenheng (HSQC) eksperiment2. Dette krever at en protein merkes jevnt med 15N, noe som oppnås vanligvis ved å uttrykke dem som affinitet-merket versjoner i E. coli bakteriekulturer vokst i 15N-beriket media. Bindingen er tydelig når HSQC spectra samlet under Serine aktiveringspunktene, avslørende topp endringer for en undergruppe av rester involvert i komplekse dannelsen. Samspillet kan skje i rask utveksling regimet hvor gratis og ligand-mettet signalene sammenfattes til ett befolkningen gjennomsnitt peak. Alternativt i langsom utveksling mellom statene, er begge signaler observert med integraler som representerer deres relative mengdene. Mens NMR lineshape analyse kan brukes til å beregne bindende slektskap i noen tilfeller metoder som MST har også vist praktisk og gir cross-validering av ekte interaksjoner.
Det oppgitte eksemplet er to proteiner som finnes i desmosomes. De megle veikryss mellom cellen overflater og cytoskeleton og megle multivalent interaksjoner mellom celle vedheft maskiner og intermediære filamenter å opprettholde integriteten til huden og hjertet vev og tåler for skjær krefter. Sykdommer kan gi når desmosomal proteiner som desmoplakin eller vimentin er kompromittert av mutasjoner eller autoantistoffer, fører til destabilization av celle-celle knutepunktene, og dermed deres samspill er av kritisk betydning3. Strukturelle grunnlaget for ligand binding av desmosomal proteiner kan være preget av NMR spektroskopi, mens interaksjoner kan kvantifiseres av MST. Metoder her ble brukt for å karakterisere samspillet mellom plakin gjenta domener (PRDs) som ofte tilstede som tandem sett som tilbyr grunnleggende grooves og vimentin, en intermediære som samhandler gjennom en syrlig overflate som sin spiralformede pakke4. Disse kompleksene dannes på cellemembranen der de ankertekst for intermediære filamenter av cellen cytoskjelett til desmosomes som kobler til tilstøtende celler, og dermed danner et nettverk av selvklebende obligasjoner som utstråler gjennom en vev.
2D 15N-løst NMR eksperiment er en av de mest brukte metodene for å vise hvordan to molekyler samhandle. Det er den mest informasjonsrikt metoden der begge partnere signaler overvåkes kontinuerlig gjennom et titrering eksperiment i løsningen tilstand. Selv om vanligvis kvalitative ved store komplekser, kan metoden også brukes i fordelaktige tilfeller for å måle bindende slektskap der NMR signaler kan spores i høy oppløsning spectra. Der tildelinger kan gjøres enkelt, kan som i mange proteiner under 20 kDa i størrelse, bindende områder også tilordnes. Utfyllende analyser som MST gir kvantitativ informasjon om interaksjoner i løsning og krever mindre protein i umerkede stater. Sammenligning av mutant bindende data er nyttig for å forsikre deg om at interaksjoner dokumentert av NMR linje utvide er ekte og ikke gjenstander av, for eksempel aggregasjon eller viskositet endringer.
Protein uttrykk
Strømlinjeforme uttrykk prosessen reduserer arbeidskraft intensiv protein produksjon. En del av denne optimaliseringsprosessen innebærer identifisering av en passende stamme av E. coli for rekombinant uttrykket protein. Belastning preferanse avhenger inkludert natur vektoren i bruk og, mer spesifikt, ultimate stabiliteten av rekombinante proteiner blir uttrykt7. Risikoen for degradering av heterologous protein av endogene E. coli proteaser reduseres ved bruk av protease mangelfull E. coli som BL21 belastningen. For gener som inneholder sjeldne kodon, kan en stamme som BL21-CodonPlus (DE3) RIPL bli foretrukket. Denne belastningen kombinerer protease mangelfull natur BL21 belastningen med flere endogene kopier av sjeldne codon tRNAs for arginin, isoleucin, proline og leucine. Alternativt, sjeldne kodon som kan kompromiss overuttrykte kan unngås ved å bestille en codon-optimalisert konstruere fra en kommersiell kilde. Mange stammer av E. coli er tilgjengelig for rekombinant genuttrykk, hver optimalisert for omgåelse av et bestemt problem under uttrykk7. I denne studien produsert standard protease mangelfull belastningen BL21(DE3) tilstrekkelig mengder av løselig protein for påfølgende rensing og analyse.
Protein rensing
Rensing protokollen for et gitt protein er ofte unik i den forstand at hver protein forblir stabil og løselig under ulike forhold som temperatur, saltkonsentrasjon eller pH. Effektiviteten gjennom affinitet kromatografi er også følsom for konsentrasjonen av eluting arter som imidazole på trinnene under en renselsesprosess. I dette arbeidet var kritisk buffer forholdene for IMAC pH for E-PRD og imidazole konsentrasjon for VimRod. En pH på 7,5 var nødvendig å unngå nedbør E-prd etter første elueringsrør fra kolonnen IMAC. For IMAC rensing av VimRod, ble øker konsentrasjonen av imidazole fra 30 til 50 mM under kolonnen wash trinn funnet for å ha en betydelig forbedring i renheten på de endelige elueringsrør fraksjonene. For elueringsrør trinn, ble øker konsentrasjonen av imidazole fra 250 til 350 mM også funnet for å forbedre avkastningen av siste tilsettes. Første forsøk på å elute protein med 250 mM imidazole førte til ufullstendig elueringsrør av VimRod som med en siste 1 M imidazole stripe av kolonnen (data ikke vist). Øker imidazole konsentrasjonen til 350 mM for tilsettes var tilstrekkelig til å gjenopprette alle protein bundet til kolonnen. S kan tjene to formål fordi det fungerer som et polering skritt for protein rensing og samtidig utføre buffer exchange. Bufferen er et kritisk punkt for påfølgende binding analyse ettersom det fjerner imidazole til elute His6-merket protein. Det fungerer også som en mulighet til å endre vilkårene som saltkonsentrasjon eller pH, som kan påvirke effekten av visse nedstrøms teknikker eller analyser. Protein termisk Skift (PTS) kan brukes til å identifisere optimal bufferne for nedstrøms analyser, spesielt for de som krever stabile protein for lengre perioder romtemperatur8,9.
Bindende analyse
Protein som nylaget er avgjørende for nøyaktig bindende analyser, selv om frosne protein kan også brukes så lenge resultatene sammenlignes. Trådformede proteiner som vimentin multimerize i en salt og pH avhengige mote, og dermed løsningen betingelse må optimaliseres og oligomeric staten anslått av en metode som sek10,11, dynamisk lys spredning 12 eller analytisk ultracentrifugation13,14,15. NMR spektroskopi er godt egnet for måling ligand interaksjoner av små proteiner atomic oppløsning. Men når et protein samhandler med større molekylet, tregere tumbling følger, og dette resulterer i tap av signaler som kan bekrefte bindende selv om det gjør ikke nødvendigvis tillater tilordning av bindende områder som vil også kreve tildeling av minst ryggraden resonanser. I dette scenariet tillater ikke NMR eksperimenter identifikasjon av webområdet interaksjon. Derfor regissert området mutagenese brukes for å identifisere kritiske rester nødvendig for bindingen. Slike mutanter derfor vise ikke signaltap. I denne protokollen, en mutert form med en substitusjon på posisjon 1914 beholder peak intensiteten i nærvær av VimRod og derfor bekrefter forstyrrelse av samspillet av E-PRD og VimRod. Tilordning av ryggrad og sidechain resonanser ville legge verdien til denne tilnærmingen, spesielt i strukturen for den gratis E-PRD har blitt løst ved Røntgenkrystallografi4. Fremtidige anvendelser av NMR inkluderer karakteristikk av komplekse interaksjoner mellom større molekyler og nytte ultra høy feltet magneter og bruk av andre observerbare grupper som 13C-merket og trifluoro metylgrupper som journalister.
MST har en rekke fordeler for å studere bindende interaksjoner16. Bindende partnerne er gratis i løsning og ikke immobilisert. Analyse av kvaliteten på prøvene er innebygd i programvaren med kvalitetskontroll rapportering av aggregering, adsorpsjon kapillærene eller utilstrekkelig fluorescerende merking av mål molekylet. Små mengder målet brukes vanligvis, konsentrasjonen av merket målet er vanligvis mellom 20-50 nM i en 10-20 μL volum/reaksjon. Denne protokollen bruker svært liten reaksjon volumer (10 μL) å maksimere konsentrasjonen av ligand som kan oppnås i titrations tillater svak bindende interaksjoner å være preget. Dette nødvendiggjør nøyaktig pipettering og omsorg blir tatt for å unngå å innføre bobler mens fortsatt grundig. Tilstrekkelig miksing er avgjørende for nøyaktig, konsekvent fluorescens målinger langs settet med føljetong fortynninger. Mengden Tween-20 i MST eksperimentene ble redusert fra en standard 0,05 0.015% til lavere tendens til å opprette bobler og forbedre miksing.
RED-Tris-NTA fargestoff gir en rask, enkel og praktisk måte å fluorescently merke noen protein som har en hans tag. Merkingen er effektivt fullført på bare 30 minutter og er veldig stramt slik at ingen fargestoff fjerningen er nødvendig. Ingen endringer er gjort til aminosyre rester i protein som kan endre egenskapene ligand binding. En påminnelse er at bare protein merkes bør ha en His6 kode. Dette krevde cleavage i koden ligand protein, E-PRD og fjerning av tag og uncleaved E-PRD med andre IMAC kolonnen trinnet. Hvis mulig, ligand protein bør være forberedt uten bruk av en hans tag. Alternativt kan proteiner covalently merkes med en fluorophore gjennom Amin kopling lysin rester eller thiol koble til cystein rester. Imidlertid må utvises ved bruk av slike systemer siden kovalente feste en fluorophore kan påvirke elektrostatisk eller polar binding interaksjoner stole på lysin- eller cystein rester. Kvantifisering av bindende affinitet mellom VimRod og E-PRD av MST var usedvanlig følsomt for salt konsentrasjon. Dette problemet ble motvirket av opprinnelig dialyzing både målet og ligand til den samme gruppen av analysebuffer. Metning av MST bindende kurven kan likevel ikke oppnås når MST analysen i nærvær av 150 mM NaCl på grunn av komplekse opptreden av VimRod. Pålitelig og fullstendig data ble oppnådd når konsentrasjonen av NaCl ble senket til 10 mM tillater nøyaktig beregning av KD. Derfor anbefales forsiktig optimalisering av løsning forhold og sammenligning med komplementære analyser til robust resultat. Videre kan MST brukes å kvantifisere den salt avhengigheten for en gitt interaksjon, kvantifisere stoichiometric egenskaper av protein interaksjoner, skjermen proteinfolding og sonde inn enzym kinetics17.
The authors have nothing to disclose.
Dette prosjektet har blitt støttet av NSERC RGPIN-2018-04994, Campus Alberta innovasjon Program (RCP-12-002 C) og Alberta Prion Research Institute / Alberta fornyer Bio løsninger (201600018), tildeles Mo og Genome Canada og Canada grunnlaget for Innovasjon stipend tildelt The Metabolomics Innovation Centre (TMIC) og NANUC.
Monolith NT.115, includes control and analysis software | NanoTemper Technologies | MO-G008 | Instrument for microscal thermophoresis |
His-Tag Labeling Kit RED-Tris-NTA | NanoTemper Technologies | MO-L008 | RED-tris-NTA dye for MST |
Standard capillaries | NanoTemper Technologies | MO-K022 | capillaries for MST |
HisTrap HP, 5 mL | GE Healthcare | 17524801 | IMAC column |
HisPur Ni-NTA resin, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 88222 | IMAC resin |
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare | 28989333 | SEC column |
TEV protease | Sigma Aldrich | T4455 | cleavage of his tag from E-PRD |
BL21(DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527H | cells for protein expression |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets EDTA-Free | Sigma Aldrich | 11873580001 | protease inhibitors for protein purification by IMAC |
TCEP, Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | reducing agent for protein purification |
Reagents (HEPES, NaCl, etc) | Sigma Aldrich | various | Preparation of media and buffers |
Ammonium chloride (15N, 99%) | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467 | isotope labelling for NMR |
D2O, Deuterium Oxide (D, 99.8%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2259 | NMR sample preparation |
DSS, Sodium 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-D6 (D,98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-8206 | reference for NMR |
Precision 5 mm NMR Tubes, 7” long | SJM/Deuterotubes | BOROECO-5-7 | NMR tubes |
NMR spectrometer (14.1 Tesla) | Bruker | acquisition of NMR data | |
TCI 5mm z-PFG cryogenic probe | Bruker | acquisition of NMR data | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Bruker TopSpin 4.0.1 | Bruker | processing of NMR data | |
MO.Control | NanoTemper Technologies | included with Monlith NT.115 | |
MO.Affinity Analysis | NanoTemper Technologies | included with Monlith NT.115 |