تصور وتتبع mRNAs الذاتية في غرف البيض الحية Drosophila الميلانوجاستر البيض
Summary
هنا، نقدم بروتوكول للتصور، والكشف، وتحليل وتتبع الاتجار بالحمض النووي الريبي في غرفة البيض الحية Drosophila melanogaster باستخدام منارات الجزيئية، وقرص الغزل المجهرية البؤرية، وتحليل مفتوح المصدر البرمجيات.
Abstract
وقد أحدثت تقنيات التصوير القائمة على الفلورة، بالاقتران مع التطورات في الفحص المجهري الضوئي، ثورة في كيفية قيام علماء الأحياء الخلوية بإجراء دراسات تصوير الخلايا الحية. وقد اتسع نطاق أساليب الكشف عن الـ RNAs بشكل كبير منذ أن ربطت الدراسات الجوهرية بين توطين الحمض النووي الريبي الخاص بالموقع وتنظيم التعبير الجيني. يمكن الآن تصور عمليات mRNA الديناميكية من خلال النهج التي تكشف عن mRNAs، إلى جانب إعداد المجهرية التي هي سريعة بما فيه الكفاية لالتقاط النطاق الديناميكي للسلوك الجزيئي. تكنولوجيا المنارة الجزيئية هي نهج قائم على التهجين قادر على الكشف المباشر عن النصوص الذاتية في الخلايا الحية. منارات جزيئيّة [هيربين-شبد], داخليّا يروي, [سنغل-نوكليوتيد] يميّز [نوكليك سد] تحقيقات, أيّ [فلورسّ] فقط على تهجين إلى تسلسل فريدة هدف. عندما يقترن مع المجهرية الفلورية المتقدمة والتصوير عالية الدقة، فإنها تمكن المرء من إجراء تتبع المكانية والزمانية للحركة داخل الخلايا من mRNAs. على الرغم من أن هذه التكنولوجيا هي الطريقة الوحيدة القادرة على الكشف عن النصوص الذاتية، علماء الأحياء الخلية لم تحتضن بعد تماما هذه التكنولوجيا بسبب صعوبات في تصميم مثل هذه التحقيقات لتصوير الخلايا الحية. تطبيق برنامج جديد، PinMol،يسمح لتصميم محسنوسريع من تحقيقات الأنسب لتهجين بكفاءة إلى المناطق المستهدفة mRNA داخل خلية حية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الحصول على الصور عالية الدقة في الوقت الحقيقي والبرمجيات الحالية المفتوحة المصدر لتحليل الصور يسمح بإخراج بيانات محسنة، مما يؤدي إلى تقييم أدق للتعقيد الكامن وراء العمليات الدينامية التي تنطوي عليها دورة حياة mRNA.
هنا نقدم بروتوكول شامل لتصميم وتسليم منارات الجزيئية في غرف البيض Drosophila melanogaster. يتم إجراء الكشف المباشر والمحدد للغاية والتصور من mRNAs الأمومية الذاتية عن طريق قرص الغزل المجهرية البؤرية. تتم معالجة بيانات التصوير وتحليلها باستخدام الكشف عن الأجسام وتتبعها في البرامج الجليدية للحصول على تفاصيل حول الحركة الديناميكية للmRNAs، والتي يتم نقلها وتوطينها إلى مناطق متخصصة داخل البويضة.
Introduction
وقد أصبحت دراسات بيولوجيا الخلايا التي تصور الأحداث الدينامية ذات الاستبانة المكانية والزمنية ممكنة من خلال تطوير تقنيات التصوير بالخلايا الحية القائمة على الفلورة. في الوقت الحاضر، في التصور mRNA الجسم الحي يتحقق من خلال التكنولوجيات التي تقوم على التفاعلات الحمض النووي الريبي aptamer البروتين، RNA aptamer الناجمة عن الفلورة من الأصباغ العضوية والحمض النووي التحقيق الصلب1،2، 3.أنها توفر كل خصوصية عالية، والحساسية ونسبة الإشارة إلى الخلفية. ومع ذلك، تتطلب النُهج التي تركز على الحمض النووي الريبي معالجة جينية واسعة النطاق، حيث يتم تصميم الترانسجين للتعبير عن الحمض النووي الريبي مع الزخارف الهيكلية الاصطناعية المطلوبة لربط البروتين أو الصبغالعضوي. على سبيل المثال، يتطلب نظام MS2/MCP التعبير المشترك عن ترانسجين يعبر عن بنية RNA تحتوي على تكرارات متعددة جنبا إلى جنب من تسلسل ملزم للبروتين معطف MS2 البكتيريا (MCP)، وترميز آخر transgene بروتين الفلورسنت تنصهر إلىMCP 4،5. إضافة مثل هذه الزخارف الهيكلية الثانوية إلى الحمض النووي الريبي، جنبا إلى جنب مع بروتين الفلورسنت ضخمة الموسومة، أثارت مخاوف من أن عمليات الحمض النووي الريبي الأصلي قد تتأثر6. ومن التقنيات التي تعالج هذا الشاغل وتقدم مزايا فريدة إضافية هي النهج القائم على الحمض النووي، ومنارات الجزيئية (MBs). تسمح الـ MBs للكشف المتعدد عن mRNAs الذاتية، والتمييز في الاختلافات النيوكليوتيدات واحدة، وحركية سريعة للتهجين مع الهدف mRNA7،8. MBs هي تحقيقات oligonucleotide التي لا تزال في أضعاف دبوس الشعر المبردة قبل أن تمر بتغيير التشوه الفلورية بمجرد أن تهجين إلى أهدافها (الشكل1C)9. وقد حققت عدة مجموعات نجاحا في استخدام MBs للكشف عن كل من RNAs غير الترميز (microRNAs وlncRNAs)10،11،12،13،RNA الفيروسات الرجعية14 ودينامية الحمض النووي البروتين التفاعلات15. وقد تم استخدامها بنجاح للتصوير في مختلف الكائنات الحية والأنسجة، مثل أجنة حمار وحشي16، الخلايا العصبية13، أنسجة الورم17، التمييز بين خلايا القلب18، والسالمونيلا 19.
هنا نقوم بوصف نهج التصميم والتسليم والكشف عن mRNAs الذاتية في غرف البيض الحية D. melanogaster إلى جانب إعداد المجهرية التي هي سريعة بما فيه الكفاية لالتقاط مجموعة ديناميكية من النقل الجزيئي النشط. وقد عملت غرفة البيض D. melanogaster كنظام نموذج متعدد الخلايا مثالية لمجموعة واسعة من الدراسات التنموية، من تقسيم الخلايا الجذعية الجرثومية في وقت مبكر والتعبير الجيني الأمومي لتوليد خطة الجسم القطاعية20، 21. غرف البيض معزولة بسهولة، كبيرة وشفافة، وقادرة على تحمل ساعات من تحليل الجسم الحي السابق، مما يجعلها قابلة للغاية لتجارب التصوير. وقد ركز الكثير من العمل على توطين النصوص النفاسية غير المتماثلة في المناطق الفرعية المنفصلة قبل ترجمتها بنشاط. على وجه الخصوص، يجب أن يحدث توطين >أوسكار ميرنا« وترجمته اللاحقة في القطب الخلفي للبويطانة بطريقة منظمة بإحكام لتجنب النمط الظاهري الجنيني الثلاثي القاتل22. يتم نسخ oskar mRNA في 15 خلية جرثومية، وتسمى خلايا الممرضة، ويتم نقلها بنشاط من خلال الجسور السيتوبلازمية، وتسمى القنوات الدائرية، إلى البويضة، والخلية الجرثومية التي تصبح البويضة الناضجة ويتم إخصابها في نهاية المطاف (الشكل1A ). إن الكم الكبير من المعلومات المتاحة بالفعل فيما يتعلق بالتوظيف الدينامي وتبادل عوامل البروتين من وإلى أوسكار mRNP، إلى جانب سفره بعيد المدى داخل الخلايا، يجعل أوسكار مرشحاً مفضلاً للدراسة العديد من العمليات من دورة حياة mRNA. وقد لعبت MBs دوراً أساسياً في الكشف عن تفاصيل حول عملية توطين الحمض النووي الريبي وفك رموز تنظيم ووظيفة عوامل البروتين التي تتحكم في نقل الحمض النووي الريبي خلال Drosophila oogenesis. على وجه الخصوص ، عن طريق حقن الـ MBs الدقيقة في خلايا الممرضة وإجراء تجارب تصوير الخلايا الحية ، من الممكن تتبع mRNAs الذاتية8،23.
تقدم خارطة الطريق المعروضة هنا خطوات عملية كاملة، من إجراء تجربة تصوير الخلايا الحية باستخدام MBs، والحصول على بيانات التصوير، إلى إجراء تحليل البيانات لتتبع الحمض النووي الريبي المحلي في بيئته الخلوية الأصلية. ويمكن تعديل الخطوات وتحسينها لتلبية احتياجات الباحثين الذين يعملون مع الأنسجة/أنواع الخلايا الأخرى داخل إعداد المختبر الخاص بهم.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعتمد التصور المباشر للاتجار بالحمض النووي الريبي المحلي في غرف البيض Drosophila على استخدام MBs محددة وفعالة ومقاومة للنوكل، والتي يمكن الآن تصميمها بسهولة مع برنامج PinMol. MBs هي تحقيقات محددة مصممة للكشف عن تسلسل فريد ة داخل mRNA الهدف (ويفضل المناطق خالية من الهيكل الثانوي)، مما يجعل من …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر سلفاتوري أ. إ. ماتراس (مركز معهد بحوث الصحة العامة، جامعة روتجرز) على تركيب ووسم وتنقية منارات جزيئية، ودانيال سانت جونستون (معهد غوردون، جامعة كامبريدج) على أوسكار-MS2/ MCP-GFP الأسهم ذبابة المعدلة وراثيا. وقد تم دعم هذا العمل من قبل جائزة المؤسسة الوطنية للعلوم الوظيفي 1149738 وجائزة مؤتمر الموظفين الفنيين – CUNY إلى DPB.
Materials
| Spectrofluorometer | Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon | n/a | Photon counting spectrofluorometer |
| Quartz cuvette | Fireflysci (former Precision Cells Inc.) | 701MFL | |
| Dumont #5 tweezer | World Precision Instruments | 501985 | Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Cover slip No.1 22 x 40mm | VWR | 48393-048 | |
| Dissecting microscope | Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. | n/a | |
| CO2 fruit fly anesthesia pad | Genesee Scienific | 59-114 | |
| Tris-HCL pH7.5 | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Spinning disc confocal microscope | Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. | n/a | |
| Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera | Hamamatsu | n/a | |
| PatchMan NP 2 Micromanipulator | Eppendorf Inc. | 920000037 | |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf Inc. | 920010504 | |
| Injection needle: Femtotips II | Eppendorf Inc. | 930000043 | |
| Loading tip: 20ul Microloader | Eppendorf Inc. | 930001007 | |
| Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22x40mm | VWR | 48393-026; 48393-172 | |
| Dry yeast | Any grocery store | n/a | |
| Computer, > 20 GB RAM | Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing |
References
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
- Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).
- Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. Current techniques for visualizing RNA in cells. F1000Research. 5, (2016).
- Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
- Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
- Garcia, J. F., Parker, R. MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5′ to 3′ degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system. RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).
- Bratu, D. P. Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells. Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).
- Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).
- Tyagi, S., Kramer, F. R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).
- Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).
- Liu, Y., et al. Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).
- Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Research. 40 (2), e13 (2012).
- Ko, H. Y., et al. A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis. Scientific Reports. 4, 4626 (2014).
- Vet, J. A., et al. Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).
- Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. Molecular beacons for protein-DNA interaction studies. Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).
- Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).
- Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells. Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).
- Ban, K., et al. Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4. Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).
- Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples. BMC Microbiology. 9, 97 (2009).
- McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).
- Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
- Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein. Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).
- Mhlanga, M. M., et al. In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte. PLoS One. 4 (7), e6241 (2009).
- Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs. bioRxiv. , (2018).
- Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes. Nucleic Acids Research. 30 (21), e122 (2002).
- Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection. Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).
- Dean, D. A. Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection. Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).
- Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
- Jackson, S. R., et al. Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells. Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).
- Zimyanin, V. L., et al. In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization. Cell. 134 (5), 843-853 (2008).
- Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. Tiny molecular beacons: LNA/2′-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells. ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), e69 (2008).
- Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Research. 32 (6), e58 (2004).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Research. 35 (16), e105 (2007).
- Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).
- Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
- Trcek, T., et al. Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters. Nature Commununications. 6, 7962 (2015).
