Visualisation et suivi des ARNm endogènes dans Live Drosophila melanogaster Egg Chambers
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour la visualisation, la détection, l’analyse et le suivi du trafic endogène d’ARNm dans la chambre d’oeufs de Melasophila melanogaster vivante utilisant des balises moléculaires, la microscopie confocale de disque spinning, et l’analyse open-source logiciel.
Abstract
Les techniques d’imagerie à base de fluorescence, combinées aux développements de la microscopie légère, ont révolutionné la façon dont les biologistes cellulaires mènent des études d’imagerie cellulaire vivante. Les méthodes de détection des ARN se sont considérablement développées depuis que les études séminales ont lié la localisation de l’ARNm spécifique au site à la régulation de l’expression génique. Les processus d’ARNm dynamique s’accompagnent désormais d’approches qui détectent les ARNm, couplées à des configurations de microscopie suffisamment rapides pour capturer la gamme dynamique du comportement moléculaire. La technologie de balise moléculaire est une approche basée sur l’hybridation capable de détecter directement les transcriptions endogènes dans les cellules vivantes. Les balises moléculaires sont en forme d’épingle à cheveux, étanchées à l’intérieur, un seul nucléotide discriminant les sondes d’acide nucléique, qui fluoresce seulement sur l’hybridation à une séquence cible unique. Lorsqu’ils sont couplés à la microscopie à fluorescence avancée et à la formation image à haute résolution, ils permettent d’effectuer un suivi spatial et temporel du mouvement intracellulaire des ARNM. Bien que cette technologie soit la seule méthode capable de détecter les transcriptions endogènes, les biologistes cellulaires n’ont pas encore pleinement adopté cette technologie en raison des difficultés dans la conception de telles sondes pour l’imagerie cellulaire vivante. Une nouvelle application logicielle, PinMol, permet une conception améliorée et rapide des sondes les mieux adaptées pour s’hybrider efficacement aux régions cibles de l’ARNm au sein d’une cellule vivante. En outre, l’acquisition d’images haute résolution et en temps réel et le logiciel actuel d’analyse d’images open source permettent une sortie de données affinée, ce qui permet une évaluation plus fine de la complexité qui sous-tend les processus dynamiques impliqués dans le cycle de vie de l’ARNm.
Nous présentons ici un protocole complet pour la conception et la livraison de balises moléculaires dans les chambres d’œufs Drosophila melanogaster. La détection et la visualisation directes et très spécifiques des ARNm maternels endogènes sont effectuées par microscopie confocale de disque tournant. Les données d’imagerie sont traitées et analysées à l’aide de la détection et du suivi d’objets dans le logiciel Icy afin d’obtenir des détails sur le mouvement dynamique des ARNM, qui sont transportés et localisés dans des régions spécialisées au sein de l’ovocyte.
Introduction
Les études de biologie cellulaire qui visualisent des événements dynamiques avec la résolution spatiale et temporelle ont été rendues possibles par le développement des techniques d’imagerie cellulaire vivante basées sur la fluorescence. Actuellement, la visualisation in vivo d’ARNm est réalisée par des technologies qui sont basées sur des interactions aptamer-protéine d’ARN, fluorescence aptamer-induite d’ARN des colorants organiques et sonde d’acide nucléique annealing1,2, 3. Ils offrent tous une grande spécificité, sensibilité et rapport signal-arrière. Cependant, les approches centrées sur l’aptamer d’ARN exigent la manipulation génétique étendue, où un transgène est conçu pour exprimer un ARN avec des motifs structurels artificiels qui sont exigés pour la liaison de protéine ou organique de colorant. Par exemple, le système MS2/MCP exige la coexpression d’un transgène exprimant une construction d’ARN contenant plusieurs répétitions en tandem de la séquence de liaison pour la protéine bactériophage MS2 (MCP), et un autre transgène codant une protéine fluorescente fusionné à MCP4,5. L’ajout de tels motifs structurels secondaires à l’ARN, ainsi qu’une protéine voilonée étiquetée fluorescente, a soulevé des préoccupations que les processus d’ARN indigènes peuvent être affectés6. Une technologie qui répond à cette préoccupation et offre d’autres avantages uniques est l’approche à base d’acide nucléique, les balises moléculaires (MBs). Les MB permettent la détection multiplexe des ARNm endogènes, la discrimination des variations nucléotides simples, et la cinétique rapide de l’hybridation avec l’ARNm cible7,8. Les MB sont des sondes oligonucléotides qui restent dans un pli d’épingle à cheveux éteint avant de subir un changement de conformationnel fluorogénique une fois qu’ils s’hybrident à leurs cibles (Figure 1C)9. Plusieurs groupes ont réussi à utiliser les MB pour détecter à la fois les ARN non codants (microARN et lncRNAs)10,11,12,13, les rétrovirus d’ARN14 et les dynamiques ADN-protéines interactions15. Ils ont été utilisés avec succès pour l’imagerie dans divers organismes et tissus, tels que les embryons de poissons zèbres16, neurones13, tissu tumoral17, différenciant cardiomyocytes18, et Salmonella 19.
Nous décrivons ici l’approche de conception, de livraison et de détection des ARNm endogènes dans les chambres d’œufs D. melanogaster vivantes couplée à une configuration de microscopie qui est assez rapide pour capturer la gamme dynamique du transport moléculaire actif. La chambre d’oeuf séminocytrale de D. melanogaster a servi de système modèle multicellulaire idéal pour un large éventail d’études développementales, de la division des cellules souches germinées précoces et de l’expression des gènes maternels à la génération du plan corporel segmentaire20, 21. Les chambres d’oeufs sont facilement isolées, grandes et translucides, et capables de résister à des heures d’analyse ex vivo, ce qui les rend très propices aux expériences d’imagerie. Beaucoup de travail a porté sur la localisation asymétrique des transcriptions maternelles aux régions subcellulaires discrètes avant d’être activement traduites. En particulier, la localisation de l’ARNm oskar et sa traduction ultérieure au pôle postérieur de l’ovocyte doivent se produire d’une manière étroitement réglementée pour éviter un phénotype d’embryon bicaudal mortel22. L’ARNm oskar est transcrit dans les 15 cellules germinales, appelées cellules d’infirmière, et activement transporté par des ponts cytoplasmiques, appelés canaux d’anneau, dans l’oocyte, la cellule germinale qui devient l’œuf mûr et est finalement fécondé (Figure 1A ). La quantité considérable d’informations déjà disponibles concernant le recrutement dynamique et l’échange de facteurs protéiques à destination et en provenance du mRNP oskar, ainsi que son voyage intracellulaire à longue portée, font d’oskar un candidat privilégié pour étudier les nombreux processus du cycle de vie de l’ARNm. Les MB ont joué un rôle déterminant dans la révélation de détails sur le processus de localisation de l’ARNm et le déchiffrement de la régulation et de la fonction des facteurs protéiques qui contrôlent le transport de l’ARNm pendant l’oogenèse de Drosophila. En particulier, en micro-injectant des MB dans les cellules d’infirmières et en effectuant des expériences d’imagerie cellulaire en direct, le suivi des ARNm endogènes est possible8,23.
La feuille de route présentée ici offre les étapes d’un processus complet, de la réalisation d’une expérience d’imagerie cellulaire en direct à l’aide de MBs, l’acquisition de données d’imagerie, à l’exécution de l’analyse des données pour suivre l’ARNm endogène dans son environnement cellulaire natif. Les étapes peuvent être modifiées et optimisées pour répondre aux besoins des chercheurs travaillant avec d’autres tissus/types de cellules dans leur propre laboratoire.
Protocol
Representative Results
Discussion
La visualisation en direct du trafic d’ARNm endogène dans les chambres d’oeufs drosophila repose sur l’utilisation de MB spécifiques, efficaces et résistants aux nucléasmes, qui peuvent maintenant être facilement conçus avec le logiciel PinMol. Les MB sont des sondes spécifiques conçues pour détecter des séquences uniques au sein d’un ARNm cible (de préférence des régions exemptes de structure secondaire), ce qui rend possible la détection d’une transcription très résolue. La seule limit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Salvatore A.E. Marras (Public Health Research Institute Center, Rutgers University) pour la synthèse, l’étiquetage et la purification des balises moléculaires, et Daniel St Johnston (The Gurdon Institute, Université de Cambridge) pour l’oskar -MS2/ Stock de mouches transgéniques MCP-GFP. Ce travail a été soutenu par un prix CARRIÈRE de la National Science Foundation 1149738 et un Prix du Congrès du personnel professionnel-CUNY à DPB.
Materials
| Spectrofluorometer | Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon | n/a | Photon counting spectrofluorometer |
| Quartz cuvette | Fireflysci (former Precision Cells Inc.) | 701MFL | |
| Dumont #5 tweezer | World Precision Instruments | 501985 | Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Cover slip No.1 22 x 40mm | VWR | 48393-048 | |
| Dissecting microscope | Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. | n/a | |
| CO2 fruit fly anesthesia pad | Genesee Scienific | 59-114 | |
| Tris-HCL pH7.5 | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Spinning disc confocal microscope | Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. | n/a | |
| Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera | Hamamatsu | n/a | |
| PatchMan NP 2 Micromanipulator | Eppendorf Inc. | 920000037 | |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf Inc. | 920010504 | |
| Injection needle: Femtotips II | Eppendorf Inc. | 930000043 | |
| Loading tip: 20ul Microloader | Eppendorf Inc. | 930001007 | |
| Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22x40mm | VWR | 48393-026; 48393-172 | |
| Dry yeast | Any grocery store | n/a | |
| Computer, > 20 GB RAM | Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing |
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