Cancer Research

ניתוח דיגיטלי של מעטפת חיסונית של חלבון ZW10 אינטראקציה רקמות ריאות האדם

Published: May 1, 2019 doi: 10.3791/58551

Yuan Wen¹, Xie Song-ping², Liu Pan³, Liu Xiao-yan¹, Pan Shan⁴, Yin Qian⁴, Sun Meng⁵, Huang Xiao-xing⁶, Xiao Rui-jing⁴, Xiong Jie⁴, Zhang Qiu-ping⁴, Shao Liang¹

¹Department of Hematology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, ²Department of Thoracic Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, ³Department of Human Anatomy, Histology and Embryology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences, School of Basic Medicine, Peking Union Medical College, ⁴Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Wuhan University, ⁵Department of Gastroenterology, Central Hospital of Wuhan, ⁶Department of Transfusion, Zhongnan Hospital of Wuhan University

Summary

ZW10 (ZWINT) משתתפת במחסום הציר הmitotic ובפתוגנזה של קרצינומה. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה של כתמים חיסוני של ZWINT ברקמות סרטן ריאות האדם, ואחריו סריקה דיגיטלית של שקופיות שלמות וניתוח תמונה. מתודולוגיה זו יכולה לספק תמונות דיגיטליות באיכות גבוהה ותוצאות אמינות.

Abstract

מטרת מחקר זה היא להחדיר מתודולוגיה של הרקמה החיסונית של רקמות הריאה האנושית, ואחריו שקופית שלמה סריקה דיגיטלית ניתוח תמונה. סריקה דיגיטלית היא דרך מהירה לסריקת ערימת שקופיות ולהפקת תמונות דיגיטליות באיכות גבוהה. זה יכול לייצר תוצאות concordant עם מיקרוסקופ אור קונבנציונאלי (CLM) על ידי פתולוגים. יתר על כן, הזמינות של תמונות דיגיטליות מאפשרת כי אותה שקופית ניתן לציין בו על ידי אנשים מרובים. יתר על כן, תמונות דיגיטליות של שקופיות ניתן לאחסן במסד נתונים, מה שאומר את הידרדרות ארוכת טווח של שקופיות זכוכית נמנעת. המגבלות של טכניקה זו הן כדלקמן. ראשית, הוא זקוק לרקמה באיכות גבוהה המוכן ואת השקופיות המקורי אימונוהיסטוכימיה (IHC) ללא כל נזק או שאריות איטום עודף. שנית, הגידול או שטחים שאינם סרטניים צריך להיות מצוין על ידי פתולוגים מנוסים לפני ניתוח באמצעות תוכנה, כדי למנוע בלבול על הגידול או אזורים שאינם סרטניים במהלך הבקיע. שלישית, המפעיל צריך לשלוט על שכפול הצבע לאורך כל תהליך הדיגיטציה בהדמיה שקופית שלמה.

Introduction

ZW10 (zwint) הוא מרכיב הכרחי של מתחם קינטוכורה אשר מעורב במחסום mitotic צירים¹^,²^,³. זה דווח כי דלדול של zwint מוביל הפרדה חריגה כרומוזום מוקדם מוקדמת¹^,²^,³. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי zwint מעורב בפתוגנזה של גידולים מרובים על ידי קידום התפשטות של תאים סרטניים⁴^,⁵. בעבר דיווחו על ביטוי יתר של ZWINT בסרטן הריאות⁵. זה התקבל באופן נרחב כי ניתוח של שקופיות על ידי פתולוגים באמצעות clm היא גוזלת זמן ולא כמותית⁶^,⁷^,⁸_. יתרה מזאת, ההידרדרות של שקופיות הזכוכית המאוחסנות עלולה לגרום לנסיגה של שקופיות שנוצרו בעבר. השיטה המתהווה של הדמיה מבוססת-מחשב, שקופית שלמה דיגיטלית (wsi) עלולה להתגבר על מגבלות אלה⁶^,⁷^,⁸.

לשם כך, אנו מתארים מתודולוגיה של התרופה החיסונית של ZWINT ברקמות סרטן ריאות האדם, בשילוב עם שקופית שלמה סריקה דיגיטלית וניתוח תמונה מבוסס תוכנה. היתרון העיקרי של מתודולוגיה זו הוא הפקת תוצאות concordant עם CLM. טכנולוגיה זו ניתן להשתמש באופן נרחב באזורים של הבקיע פתולוגי של המטאוקסילין-אאוזין כתמים (H & E) ו-IHC, הזריחה ב היברידיזציה באתרו (דג), מיקרו מערכי רקמות (tma), וגילוי סמים ופיתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה האתית של בית החולים Zhongnan של ווהאן והחולים רנמין באוניברסיטת ווהאן.

1. הכנת שקופיות IHC

לתקן את דגימת רקמת הריאה על ידי האישר רסיס רקמת הריאה האנושית (כ 3 x 3 ס מ) ב 4% פאראפורמלדהיד באגירה פוספט מתכלה (PBS) עבור 24 h בטמפרטורת החדר (RT).
מייבשים את הרקמה ב 80%, 95%, ו 100% אתנול עבור 15 דקות, 20 דקות, ו 20 דקות, בהתאמה, בטמפרטורת החדר. לבסוף, לטבול את הרקמה 100% קסילן 3x עבור 20 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר.
להטבעת, לטבול את הרקמה בפרפין (63 ° c) עבור 30 דקות. שינוי פרפין לטבול את הרקמה שוב עבור 45 דקות נוספות. לבסוף, לשנות את הפרפין שוב ולטבול את הרקמה בו עבור 1 h.
השתמש מיקרוטומה רוטרי לחתוך את הרקמה לתוך 5 μm-עובי מקטעים ולמקם אותם על 20 μg/mL פולי-L-ליזין מצופה מגלשות.
עבור הסרת שעווה, למקם את השקופיות בתנור 65 ° c עבור 2 h ולאחר מכן, לטבול את הסעיפים diמתילבנזן עבור 15 דקות, ואחריו הטבילה ב 100% קסילן עבור 15 דקות.
מימה את השקופיות עם סעיפים הרקמה 2x עבור 5 דקות ב 100% אתנול, ואחריו טיפול עם אתנול מדולל באופן סדרתי של 5 דקות ב 95% אתנול, 5 דקות ב 80% אתנול, 5 דקות ב 70% אתנול, ו 5 דקות ב 50% אתנול.
בצע תיקון אנטיגן.
1. לדלל חומצת לימון לתקן נוזל (20x) ל-1x עם מזוקקים פעמיים H₂o (ddh₂o).
2. מניחים את השקופיות עם מקטעי הרקמה ואת חומצת לימון 1 x לתקן נוזל (300 mL) בתיבת תיקון אנטיגן ולאחר מכן, לחמם אותם במיקרוגל בחשמל גבוה עבור 2 דקות, ואחריו חימום בחשמל נמוך כדי לקיים הרתיחה עבור 6 דקות.
3. אפשר לקטעים להתקרר באופן טבעי לטמפרטורת החדר.
4. להחליף את חומצת לימון לתקן נוזל עם 0.01 M PBS, לשטוף את סעיפים 3x, בכל פעם עבור 5 דקות, ב שייקר רוטרי בטמפרטורת החדר.
. סלק את הperoxidase האנדודוגני
1. לדלל 30% של H₂או₂ כדי 3% עם ddh₂o, להוסיף אותו לשקופיות (לוודא שהוא מכסה את כל הרקמות), ו מודיית את השקופיות בתיבה רטובה בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות.
  הערה: התיבה הרטובה היא קופסת פלסטיק של 10 x 15 ס מ והיא יכולה להכיל מים.
2. לשטוף את השקופיות 3x, בכל פעם עבור 5 דקות, עם 0.01 M PBS ב שייקר רוטרי בטמפרטורת החדר.
חסום את האנטיגן הלא ספציפי.
1. לדלל את סרום העז הרגיל מרוכז 10% סרום עז עם PBS עם 0.1% רצף 20 (PBST).
2. הוסף 10% סרום עז לשקופיות ומודחים אותם בקופסה רטובה ב 37 ° c עבור 30 דקות.
  הערה: סרום העז צריך לכסות את כל הרקמות בשקופיות.
. להכתים את הרקמות
1. מאסטר השקופיות עם הארנב אנטי-ZWINT נוגדן נגד האדם (1:50) ב 4 ° c הלילה.
2. לשטוף את השקופיות 3x, בכל פעם עבור 5 דקות, עם 0.01 M PBST (1 מ ל של 0.1% רצף 20 ב 1,000 mL) ב שייקר רוטרי בטמפרטורת החדר.
3. דגירה את השקופיות עם נוגדן משני (מערכת איתור הארנב, 1:200) עבור 30 דקות ב 37 ° c.
4. לשטוף את השקופיות 3x, בכל פעם עבור 5 דקות, עם 0.01 M PBST ב שייקר רוטרי.
כדי להמחיש את הנוגדנים, להוסיף את השקופיות 300 μL של טרי 3, 3-diaminobidine ולאחר מכן, לשטוף את השקופיות עם מים ברז בטמפרטורת החדר.
הערה: מידת הצביעה מפוקחת תחת מיקרוסקופ (הגדלה 10X-40X).
. להכתים את הרקמה הכתם את השקופיות עם המטאוקסילין מכתים פתרון עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן, שטוף את השקופיות עם מי ברז עבור 15 דקות.
הערה: הגרעין נראה כחול תחת המיקרוסקופ (הגדלה 10X-40X). אם המידה של כתמים כחולים הוא חזק יותר, בידול אלכוהול הידרוכלורית עבור 3-5 s יכול לשמש, ואחריו שטיפה את רקמת בחזרה כחול עם מים ברז עבור 15 דקות כדי להקל על כתמים בולטים של הרקמה.
מייבשים את השקופיות עבור 5 דקות ב 50% אתנול, 5 דקות ב 70% אתנול, 2x ב 80% אתנול עבור 5 דקות, 5 דקות ב 95% אתנול, ולבסוף, 2x עבור 5 דקות כל אחד ב 100% אתנול בטמפרטורת החדר.
עבור שקיפות, לטבול את מקטעי הרקמה במיכל המכיל 100% קסילן עבור 15 דקות ולהעביר את הסעיפים למיכל אחר המכיל 100% קסילן עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר.
עבור איטום, לקחת 50-100 μL של מסטיק נייטרלי ולהוסיף 5% קסילן לתערובת (להימנע ערבוב בועות). הוסף 15 μL של התערובת הנ ל לסעיפים רקמת הריאה. חותם את הסרט עם זכוכית כיסוי ובעדינות ללחוץ את הבועות החוצה.

2. השלמה אוטומטית-סריקת שקופיות של IHC

הניחו לשקופיות החתומות להתייבש במשך 12 שעות בטמפרטורת החדר כדי להתייבש.
בחר באפשרות השדה הבהיר באופן ידני והזן את ממשק הסריקה הידני.
שנה את שם השקופיות ובחר נתיב אחסון עבור התמונות.
הגדר את אזור הסריקה ובחר את האפשרויות סריקת דוגמאות באמצעות ספי הגדרת משתמש. הסף הוא על 50 עם ערך הרחבה סריקה שטח של 200 μm.
הגדר את ערך מוקד הסריקה, בחר את המוקד באופן אוטומטי — הוא נע בין 1050 ל-2650-ולבסוף, בחר במצב בשכבה אחת.
טען את שקופיות IHC בתחנת העבודה והפעל את הסריקה האוטומטית.
הערה: ודא שהשקופיות אינן פגומות. שמירה על שקופיות נקיות ושקופות והימנעו מאבק, קונפטי ושאריות איטום עודפים על השקופיות. שקופית הזכוכית והכיסויים. צריכים להיות נטולי סימנים אל תנקה את השקופיות עם קסילן. גודל השקופיות מוענק בטבלה 1.
סרוק באופן אוטומטי את כל מקטע הרקמה בשקופית עם הגדלה של 20X, 40X או 100X.
אסוף ואחסן את התמונות בסוף סריקת השקופיות כולה.

3. ניתוח השקופיות באמצעות תוכנת דימות

הפעל את תוכנת ניתוח התמונה histopathological ובחר מחשב מקומי.
פתח את הקובץ שמאחסן את נתוני הסריקה.
בחר את רמת הזום המתאימה מהטווח 2X עד 40X.
כוונן את הצבע כדי לקבוע את הניגודיות המיטבית באמצעות התאמת צבעדו-מצבי.
עיגול ידני ושמו את החלקים המעניינים בכל תמונה.
הערה: למשל, אתה יכול להקיף אזור אחד ולשם אותו כמו אזור הגידול.
בחר תוספים ו- QC. . בשלב זה , בונה התרחישים צץ
בחר quant צפיפות והתאם את סרגל הזיהוי.
הערה: יש לבצע תהליך זה בזהירות. בר הסובלנות הכחולה משמש להתאמת הצבע של הגרעין התאי. סרגל העמידות החום משמש להתאמת הרוויה של צבע המילוי בתמונה. תוצאות התמונות לאחר ההתאמות צריכות להיות עקביות עם הקבצים המקבילים המקוריים.
כוונן את רמות הניקוד כדי להפוך את עוצמת הצביעה של האזורים המוקפים בעיגול בדומה לזו של התמונות המקוריות.
הערה: חום כהה מציין חיובי חזק, צהוב חום הוא חיובי למדי, צהוב בהיר הוא חלש, ולבן הוא שלילי.
אחסן והשם את המודל כקובץ. החל את המודל על שקופיות אחרות ובחר ביאור נבחר".
תן לתוכנה לחשב באופן אוטומטי את תוצאת ה-H של האזורים המוקפים בתמונה.

4. קוונפיקציה של הציונים באמצעות מערכת הניקוד H⁹^,¹⁰

חישוב אחוז הנוגדנים ועוצמת הצביעה (0: שלילי, 1 +: חלש, 2 +: בינוני, 3 +: חזק).
השתמש במערכת הבקיע (H-score) כדי לחשב את הניקוד הפתולוגי של הגידול ואזורים סמוכים שאינם סרטניים.
הערה: H-score = (% של תאים עם עוצמה חלשה x 1) + (% של תאים עם עוצמה מתונה x 2) + (% של תאים עם עוצמה חזקה x 3). לכן, ה-H-score המקסימלי הוא 300 אם 100% מהתאים מתבכמת בעוצמה חזקה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מדדנו את רמות הביטוי של ZWINT ב 28 זוגות של שאינם קטנים-תאים סרטן הריאות (NSCLC) דגימות (הגידול הסמוך רקמות שאינם סרטניים), כולל 14 תאים קשקשיים קרצינומה (SCCs) ו 14 אדנוקרצינומות (ADCs), על ידי IHC. הסריקה הדיגיטלית השלמה של השקופיות המסופקות תמונות דיגיטליות באיכות גבוהה (איור 1A). התוצאות הראו כי הציון ה-H של סרטן הריאות היה גבוה משמעותית מזה של רקמות סמוכות שאינן סרטן (P < 0.0001, דו-זנבית t-Test) (איור 1A ו- 1a). בנוסף, מצאנו כי רמת הביטוי של ZWINT ב SCCs היה גבוה משמעותית מזה ב-ADCs (איור 1C).

איור 1 : מכתים אימונוהיסטוכימיה לרקמות סרטן ריאות. דמות זו שונתה מיואן ואח אל. ⁵ עם אישור מעיתונות דאב. (א) פאנל זה מציג את מייצגת הדמויות האימונוהיסטוכימיה של חולי סרטן הריאות (המאצות: 10x ו-40x). (ב) פאנל זה מציג את ה-H-ציון של סרטן ריאות ורקמות סמוכות שאינן סרטן. (ג) פאנל זה מציג את הציון הגבוה של adcs ו-sccs. קווי השגיאה מציינים את סטיית התקן. * P < 0.05; . פי < 0.001 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

	MIN (ממ)	מקס (ממ)
רוחב	25	26
אורך	75	76
עובי	0.9	1.2

טבלה 1: גודל שקופית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

סריקת שקופית שלמה הופכת לנושא חם עבור סריקה והפקה איתנה של תמונות באיכות גבוהה למטרות קליניות ומחקר¹¹^,¹²^,¹³. ניתן לייצר תמונות על ידי מיקרוסקופים סריקה שקופיות בתוך דקות¹¹^,¹²^,¹³. על-ידי החלת מתודולוגיה זו, הצלחנו להשיג תמונות באיכות גבוהה עבור שקופיות של ZWINT IHC ולהשוות את ה-H-ניקוד בין רקמות הגידול לבין שאינם סרטניים. בפרוטוקול המוצג כאן, השלבים הקריטיים ביותר הם הכנת מגלשות ה-ihc באיכות גבוהה, רכישת התמונה והמפרט של אזורי הגידול והגידול לפני הניקוד הפתולוגי¹³^,¹⁴ ^, מיכל ^{בן 15} ^, . ^{שישה עשרה}

לשיטה הנוכחית יש כמה יתרונות לעומת (CLM). סריקה דיגיטלית מהירה מספיק (~ 20 שקופיות/שעה) כדי לסרוק ערימת שקופיות ולהפיק תמונות דיגיטליות באיכות גבוהה. זה יכול לייצר תוצאות concordant עם CLM אבל לוקח פחות זמן יחסית. הזמינות של תמונות דיגיטליות מאפשרת שניתן לצפות באותה שקופית בו על-ידי אנשים מרובים. תמונות דיגיטליות של שקופיות יכולות להיות מאוחסנות במסד נתונים, כלומר הידרדרות לטווח ארוך של שקופיות זכוכית נמנעת.

המגבלות של טכניקה זו כוללות את הצורך ברקמות באיכות גבוהה ו-ihc שקופיות⁶^,⁸^,¹¹ ומומחיות טכנית כדי לציין את דגימות הגידול או רקמות שאינן גידולים לפני ניתוח באמצעות תוכנת הדמיה , על מנת למנוע כל בלבול על הגידול או האזורים שאינם סרטניים במהלך הבקיע⁶^,⁷. המפעיל גם צריך לפקח על שכפול הצבע לאורך כל תהליך הדיגיטציה בהדמיה שקופית שלמה¹⁷.

שיטה זו ניתן להחיל באופן פעיל דגים, tma, וגילוי התרופה ופיתוח⁶^,¹⁸. Tabata ואח ' חקרו את השימוש ב-wsi באבחנות פתולוגיים מרכזיות¹⁹. הם ניתחו באופן מיוחד 1070 WSI דגימות מתשעה בתי חולים ביפן ואישר את האימות של השימוש WSI באבחונים הראשוניים. אחד היתרונות העיקריים של WSI הוא שהוא מאפשר צפייה בו של השקופיות על ידי תלמידים מרובים²⁰. לפיכך, האימות של תמונות סריקה של השקופיות השלמה עשוי לתרום לפיתוח אבחון דיגיטלי למטרות חינוכיות ומחקר⁶^,¹⁸^,²¹.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

פרויקט זה היה נתמך על ידי הקרן הלאומית הטבעית של סין (No. 81500151, 81400121, 81270607, 81541027, ו 81501352) ואת היסוד הטבעי של מחוז חוביי (סין) (No 2017CFB631). המחברים מבטאים את הערכתם לגואיי קין, צ'אנג מין, לי הוי, ועמיתיו בחברת ווהאן Google ביולוגית טכנולוגיה ושות, בע מ עבור התמיכה הטכנית שלהם. המחברים גם מודים למוחמד ג'מאל על עריכת השפה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pannoramic MIDI	3D HISTECH	Cat: PMIDI-040709	An automated digital slide scanner with a remarkable feature set :12-slide capacity, fluorescence scanning, and many more.
QuantCenter	3D HISTECH	Downloaded from the official website of the company	The framework for 3DHISTCH's image analysis applications.
LEICA RM2235	Leica Microsystems	Cat: 14050038604	The enhanced precision of the new accessories will add convenience to block to knife approach as well as specimen orientation.
Rabbit anti-human Anti-ZWINT antibody	Abcam	Cat: ab197794	Immunohistochemical analysis of ZWINT in human lung tissue.
Anti-rabbit secondary antibody	Wuhan Goodbio Technology	Cat:GB23303-1	Secondary antibody for IHC staining.
Phosphate-buffered saline	Wuhan Goodbio Technology	Cat:G0002	A solution containing a phosphate buffer.
OLYMPUS CX23	OLYMPUS	Cat:6M87620	Microscope for detection of H&E or IHC slides.
Dimethylbenzene	Shanghai Lingfeng Chemical Reagent	Cat:1330-20-7	A colorless, flammable fluid used as a solvent and clarifying agent in the preparation of tissue sections for microscopic study.
Hematoxylin Staining Solution	Wuhan Servicebio technology	Cat:G1039	It is commonly used for histologic studies, oftern colors the nuclei of cells blue.
Tween 20	Baitg	Cat:2005-64-5	It is a polysorbate-type nonionic surfactant formed by the ethoxylation of sorbitan before the addition of lauric acid. It is used as a deterent and emulsifier in pharmacological applications.
Citric acid repair liquid	Wuhan Servicebio technology	Cat:G1202	Is is used to repair antigen after fixation during IHC procedure.
LEICA ASP200s	Leica	Cat: 14048043626	It was designed for routine and research histopathology of up to 200 cassettes.
LEICA Arcadia H	Leica	Cat: 14039354103	It is a heated paraffin embedding station and allows for simple operation and precise control, resulting in improved quality, a smooth workflow and reliability.
LEICA Arcadia C	Leica	Cat: 14039354102	It is a cold plate holding more than 60/65 cassettes on its large working surface. It was designed with an environment adaptive control module to make sure the operating temperature is always stabilized at -6°C.
CaseViewer Software	3DHISTECH