I elektrofysiologiske målinger forstyrrer tilstedeværelsen av en diffusjon potensielle den presise målingen av omvendt potensialet ved å endre elektroden potensielle. Bruke en mikro-agar salt bro, er virkningen av spredningen potensielle minimert, noe som gir mer nøyaktig måling av underlaget omsetning antall rekonstituert rekombinant membran proteiner.
Hittil mål mer enn 50% av alle farmakologiske narkotika transport kinetics membran proteiner. Elektrofysiologiske karakterisering av membran carrier proteiner rekonstituert i lipid bilayer membraner er en kraftig men delikat metode for vurdering av mekanisk- og Farmakologiske egenskaper. Omsetning er underlaget en unik parameter som gjør sammenligning av aktiviteten til forskjellige membran proteiner. I et electrogenic transport skaper gradient av translocated underlaget en membran potensial som direkte korrelerer til underlaget omløpshastighet av protein. Ved hjelp av sølv klorid elektroder, er en diffusjon potensial, også kalt flytende krysset potensial, indusert, som endrer elektrode potensial og betydelig forstyrrer presis membran potensielle mål. Diffusjon potensielle kan reduseres ved en salt bro, som balanserer elektrode potensial. I denne artikkelen er en mikro-agar salt bro utformet for å forbedre elektrofysiologiske satt opp, som bruker Mikropipetter for membran dannelsen. Salt løsning er fylt inn i en microcapillary pipette tips, stabilisert med tillegg av agarose, og lett kan monteres på et standard elektroden. Elektroden potensialet i en mikro-salt bro elektrode er mer stabilt sammenlignet med en standard elektrode. Gjennomføringen av dette systemet stabiliserer elektrode potensielle og gir mer nøyaktige mål av membran potensial generert av pH gradering. Bruke dette systemet, er proton omsetning PR av mitokondrie bærere UCP1 og UCP3 reinvestigated og i forhold til tidligere målinger.
Membran proteiner er rettet opp til 60% av alle kjente legemidler1. Elektrofysiologiske målinger av membran proteiner er en kraftig men delikat verktøy for å analysere electrogenic transport av underlag mediert av membran carrier proteiner. Modulering av transmembrane gjeldende ved anvendelse av konstant spenninger eller spenning ramper kan vurdere de farmakologiske og fysiske egenskapene av bærere, for eksempel aktivisering og hemming av underlag eller transport Kinetics. Av spesiell interesse er substrat omsetning tall, som viser hvor mye substrat som er translocated av en membran protein per tidsenhet. Det er en viktig parameter når du sammenligner kinetics av membran. Etablere en konsentrasjon gradient ladet underlaget over membranen genererer en Elektromotorisk kraft som omsetning antall underlaget er utledet.
Bruke en AgCl elektrode, skaper tilstedeværelsen av en flammehemmende buffer et diffusjon potensial som endrer elektrode potensielle og fører til en endring i nåværende-spenning mål2. Selv om det er alltid til stede, det er ubetydelig for standard konduktans og kapasitet målinger siden disse parameterne er avhengig av skråningen av gjeldende-spenning innspilling (konduktans) eller er forskjellen på en enkelt innspilling (kapasitet), som avbryter potensial. Imidlertid kan innspillingen av omvendt potensial, som opprettes av transport av underlaget, bli betydelig forstyrret av spredningen potensielle. Dermed for nøyaktige målinger av omvendt potensialet må elektrode potensialene holdes konstant.
Spredningen potensielle kan reduseres ved to metoder: (i) i nærvær av en bilayer membran, en substrat konsentrasjon har økes på én side av membran3,4, eller (ii) en salt bro balanserer elektroden potensielle 5. den første metoden er svært avhengig av stabiliteten av målinger. Membranen må overleve i flere minutter, fra tillegg av underlaget under omrøring til underlaget er nesten like distribuert i løsningen. Hvis membranen brudd i mellom, substrat forløpningen endres av den frie utvekslingen av ladet molekyler og målinger slå unøyaktig. Sistnevnte balanserer spredningen potensial, men er begrenset av størrelsen på oppsettet. Implementere en liten men virker salt broen i mikro området til en elektrofysiologiske oppsett er utfordrende6. For den sistnevnte, salt løsning fylles inn et microcapillary tips og stabilisert med tillegg av agarose å hindre spredning av salt løsning til buffer løsning.
En enkel produksjon av en mikro-agar salt bro og implementering i et elektrofysiologiske oppsett basert på pipette oppsett7 er beskrevet i denne protokollen. En microcapillary tips justeres både inneholder en 3 M KCl løsning med 1 mol % (w/v) agarose og bygge en AgCl elektrode og buffer løsning. Fordelen av mikro-salt broen vises tidsregistreringer av elektroden potensielle skiftet og mer presise målinger av membran potensial på ulike pH graderinger. I modellen systemet rekombinante proteiner rekonstituert i liposomer, er omsetning PR av mitokondrie bærere UCP1 og UCP3 produsert under like forhold reinvestigated og i forhold til tidligere resultater3,8.
Gjennomføringen av mikro-agar salt broen med elektroden minimerer sin diffusjon potensielle og gir mer nøyaktige mål av membran potensial generert av pH gradering. I nærvær av ulike transmembrane pH graderinger, potensielle skifte av begge elektrodene var akseptabelt på ΔpH = 0,35 når sammenligne den teoretiske verdien av han likevekt potensielle (Φhan = 23.8 mV for ΔpH = 0,4). Imidlertid på flere fysiologisk pH graderinger, som for forekomst i mitokondrier mellom matrix og intermembrane plass, standard AgCl elektroden mislyktes å presist måle potensielle Skift på ΔpH = 1 (Figur 3A). Elektroden bro med mikro-agar salt levert verdiene som var mye mer sammenlignes teorien.
Diffusjon potensielle kan også oppstå på AgCl referanse elektrode hvis buffer løsning endres under eksperimentet. Flammehemmende buffer løsning ble brukt i eksperimentene siden uncoupling proteiner ble foreslått for å transportere kloridioner, og pH ble justert med Tris eller MES. Elektroden potensial, i fravær av en betydelig konsentrasjon av klorider, avhenger først og fremst klorid urenheter i buffer løsning. Komposisjonen er uendret under forsøkene, vil det bare resultere i en konstant offset potensial. Men for måling av en absolutt potensielle forskjellen mellom de to elektrodene, kan en enkel agar salt-broen system (Ag/AgCl 3 M KCl) også brukes for referanse elektroden.
En mikro-agar salt bro balanserer spredningen potensielle ved en balanse av elektroden potensielle. For å stabilisere salt løsning, ble 1% (w/v) agarose lagt til hindre blanding av salt løsning med buffer løsning. De salt ionene K+ og Cl– har lignende mobilities i væske og balansere elektroden potensielle. For å installere riktig salt broen, må agar salt løsning være tilstrekkelig varmet opp å fylle microcapillary spissen uten noen luftbobler og å dekke AgCl elektroden. Før videre behandling har elektrisk kontakt mellom salt bro elektroden og referanse elektroden sjekkes. Avhengig salt broen brukes, må salt løsning være tilstrekkelig gelled for å hindre en blanding av salt løsning med bufferen. Dette er spesielt viktig hvis K+ eller Cl– transportører er undersøkt. Salt broen ble brukt for en svært kort tid og tilsettes av agarose er ubetydelig i dette tidsintervallet. En høyere konsentrasjon av agarose inntil 5% eller agar (3% – 5%), kan bruke salt broen i lengre tid6,12.
Denne metoden kan bestemme transport kinetics av en membran transporter (i) med lav Omsetningshastigheten og (ii) mitokondrie proteiner av interne membran, som kan knapt bli undersøkt i standard patch klemme set-ups13. Sin presisjon er hovedsakelig avhengig omvendt potensielle måling, der nøyaktighet er redusert på en lav total membran konduktans og små konsentrasjon forløpninger som induserer en membran potensial under lyden av innspillingen.
Bruker dette oppsettet, ble omsetning PR av UCP1 og UCP3 som produseres under samme vilkår målt. På grunn av høyere pH gradient synes innhentet priser å være mer presis og Uaffisert av gjenstander som følge av mindre elektrode potensielle skiftet. Det kan brukes å analysere og sammenligne mitokondrie membran transportører produsert under like forhold.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av den østerrikske Research Fund (P31559-B20 til E.E.P.). Forfatterne takker Sarah Bardakji for utmerket teknisk assistanse i produksjon og rekonstituering av mus UCP1 og UCP3 i proteoliposomes.
Microloader tips | Eppendorf | 5242956.003 | Microcapillary pipette tip |
Ethanol 99% | AustrAlco Österr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H | AAAH-5020-07025-230317 | |
Kaliumchlorid | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 6781.3 | |
DC supply | Voltcraft | V10/CPG 1940 -01 | |
Agarose Standard | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 3810.2 | |
Patch Clamp Amplifier | Heka | ||
Sample tube | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 5863.1 | |
Na2SO4 | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 8560.3 | |
MES | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 4256.2 | |
TRIS | Carl Roth GmbH + Co. Kg | AE15.2 | |
EGTA | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 3054.1 | |
Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-100ML | |
Hexadecane | Sigma-Aldrich | 296317-100ML | |
Heating wire | Voltcraft | USPS-2250 |