Vi tilbyr en metode for generasjon, dyrking og systematisk analyse av organotypic skiver avledet fra murine lunge svulst. Vi beskriver også hvordan å optimalisere for skive tykkelse, og velge narkotika konsentrasjoner å behandle svulst skiver.
Organotypic primære vev explant kulturer, som inkluderer presisjonsstyrte kutte skiver, representerer tredimensjonale (3D) vev arkitektur samt flercellet samspillet av innfødte vev. Vev skiver umiddelbart kuttet fra ferske resected svulster bevare romlige aspekter av intratumor heterogenitet, noe som gjør dem nyttige surrogater i vivo biologi. Forsiktig optimalisering av vev slice forberedelse og dyrking er grunnleggende for prediktiv diagnostiske potensialet i svulst stykke explants. I denne forbindelse er murine modeller verdifull, som disse gir en konsekvent flyt av svulst materiale å utføre replikere og reproduserbar eksperimenter. Denne protokollen beskriver dyrking av murine lunge svulst-avledet vev skiver med en roterende inkubasjon enhet, et system som lar intermitterende eksponering for vev oksygen og næringsstoffer. Tidligere arbeidet viste at bruk av roterende inkubasjon enheter forbedrer levedyktigheten til vev sammenlignet med andre kultur metoder, spesielt flytende skiver og stillestående filteret støtter. Her vi videre vise at skive tykkelse påvirker levedyktighet av kultivert skiver, antyder at optimalisering av skive tykkelse bør gjøres for ulike vev typer. Uttales ITH i relevante kreftfremkallende funksjoner, som signaliserer aktiviteter, stromal cell infiltrasjon eller uttrykk for differensiering markører, nødvendiggjør evaluering av tilstøtende vev skiver for uttrykket av markører endres av behandling eller dyrking selv. Oppsummert denne protokollen beskriver generering av murine lunge svulst skiver og deres kultur i en roterende inkubasjon enhet og demonstrerer hvordan skiver bør analyseres systematisk for uttrykket av heterogen vev markører, som en forutsetning før medikament svar studier.
Solid tumor vev, inkludert lungekreft, utstilling genetiske og fenotypiske heterogenitet, og havn komplekse microenvironments1,2. Samspillet mellom tumorceller og deres omliggende microenvironment innflytelse på narkotika følsomhet og motstand mekanismer3. Dette understreker behovet for prekliniske modeller som kan nøyaktig modell biologiske kompleksiteten og funksjoner i native svulster. Presisjonsstyrte kutte skiver umiddelbart avledet fra frisk svulster gir en unik ressurs, som de har en rektor representerer i vivo biologi, i det minste for en kort vindu av tid, inkludert fenotyper romlig distribuert i en individuell svulst. Kappet klinisk svulster er en av de få personlige prøvene som kan fås fra en kreftpasient, og deres diagnostisk bruk fortjener gransking.
Historien om organotypic kulturer dateres tilbake til det tidlig 19th århundret, da menneskelige intrakranielt svulster var hånd-kutt i vev biter og kultivert med den såkalte hengende slipp-metoden. Vev fragmenter ble knyttet til en dekkglassvæske og lov til å dyppe i heparinized humant plasma, hvoretter coverslips var invertert, forseglet og kultivert for flere uker4. Manuelt klippe svulst stykker har siden vært kulturperler bruker en rekke andre metoder, som på plasma clots5, i flytende media6, eller på 0,45 µm pore størrelse filtre6. Begrepet “organotypic” ble først brukt i 1954, i en studie på netthinnen differensiering av chick embryoet øye7. Dette ble etterfulgt av studier som brukes lunge og hjerte vev explants av kylling embryoer8og hjernen explants voksen rotter9.
Ulike metoder for kutting har vært beskrevet, nemlig manuell helikoptre10,11, Krumdieck vev slicer12,13og vibratomes11,14,15, 16. Krumdieck vev sliceren genererer sylindriske vev kjerner, som er så skiver i sirkulære vev skiver med en mikrotom. En vibratome, derimot, bruker en vibrerende blad mikrotomen. I en studie på leveren skiver, ble det vist at Leica vibratome genererer mer reproduserbare og konsekvent skiver sammenlignet med Krumdieck slicer15. Skive tykkelser alt 250 til 500 µm har blitt brukt, og studier rapporterer vedlikehold av levedyktighet og morfologiske funksjoner til 16 dager14,10,17,18. Imidlertid tumorer har variabel metabolske profiler som kan påvirke næringsinnhold krav og parametere som vev stivhet og matrix komposisjon kan påvirke på lufting og næringsstoffer flyt. Det er derfor sannsynlig at hver vev type krever optimalisering av kutting og kultur.
Forskjellige dyrkingsmetoder brukes til å støtte skive kulturer: jeg) stasjonære interphase kultur, også kalt stillestående støtte kultur, som er skiver plassert på en semi porøs membran setter nedsenket i kultur medium. I dette utsatt toppen av skiver for luften, mens bunnen er supplert med næringsstoffer via porøse sett inn14,19; II) murskje metoden opprinnelig utviklet kultur hele organer eller embryonale vev skiver. I dette, skiver er plassert på en bomull ark eller filter støttes av en og filteret er dynket i kultur medium. For å holde vev fuktig, legges et tynt lag med middels på skiver20,21,22. De to første er såkalte luft-flytende interphase kulturer; III) valse røret kulturer, der stykker plasseres innenfor den flate siden av et plastrør som inneholder mediet, og langsom tube rotasjon sikrer at vevet er dekket med medium i første del av en syklus, eller karbonisert under andre23; IV) roterende inkubasjon enheter, der skiver er midlertidig utsatt for medium med næringsstoffer og lufting. Forskjellig fra Berg rør, i denne metoden skiver er plassert på porøse Titan rutenett i 6-vel plater med kultur medium24.
Vev skiver avledet fra resected solide svulster Commit en attraktiv ex vivo modell å teste behandlingsrespons anti-kreft agenter, som de tillater evaluering av levedyktighet, målrettet veien aktivitet og molekylære profiler en bestemt svulst i nærvær av sine opprinnelige svulsten microenvironment. Men for å vurdere om narkotika svarene målt i svulst skiver er prediktive for i situ svar, er det viktig å vurdere hvilken grad vev skiver beholde svulst-spesifikke biologiske funksjoner som celle spredning, histopatologi-spesifikk celledifferensiering eller kreftfremkallende signalnettverk aktiviteter. Virkningen av mekanisk stress elicited under skive forberedelse, slice håndtering eller kultur-indusert tilpasninger på både kvalitet og biologiske funksjoner av vev skiver er grunnleggende spørsmål, tett knyttet til evnen til å implementere svulst-avledet skiver for funksjonell diagnostikk.
Våre IMI-finansierte consortium prosjektet PREDECT (http://www.predect.eu) setter ut til systematisk adresse disse grunnleggende spørsmålene, ved å studere slice explants fra en rekke kilder. Bruker skiver avledet fra lunge, bryst og prostata kreft modeller, utnyttet denne felles innsats kvalitative read-outs samt kvantitative hematoxylin og eosin (H & E) – basert readouts å demonstrere en forutsetning for atmosfærisk oksygen og stillestående filter hjelper å opprettholde levedyktigheten til kulturperler skiver til 72 h. Videre immunohistochemistry (IHC) analyser på kulturperler skiver avslørt intra-skive levedyktighet graderinger, dokumentert som nekrose graderinger i skiver avledet fra murine ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), østrogenreseptor (ER), HIF1α og γH2AX graderinger i bryst kreft skiver eller androgen reseptoren (AR) uttrykk graderinger i prostatakreft skiver25. Interessant, intra-skive levedyktighet graderinger i 24 h kulturer av murine NSCLC ble reddet av dyrking i en roterende inkubasjon enhet, og vår siste studie viste at levedyktighet ble utvidet til 72 h26. Spesielt oversiden forble mest levedyktige26, godkjenne narkotika svar analyser på skiver utføres best på denne siden av vev.
Selv om det fortsatt et spørsmål om hvordan langt vev skiver kan recapitulate i situ svulst funksjoner, de har blitt brukt til å teste Svar å anti-kreft agenter, inkludert målrettet narkotika, monoklonale antistoffer og kjemoterapi agenter 10,,11,,13,,14,,18,,27. Vi har nylig viste at murine NSCLC skiver vise dynamiske endringer i spredning og kreftfremkallende signalnettverk aktiviteter etter dyrking sammenlignet med fersk kuttet 0t skiver26. Dette indikerer at det er viktig å undersøke om målrettet i situ biologiske funksjonene beholdes riktig under dyrking, før forstyrrelsene studier. Til tross for disse funnene, vi viste at svulsten skiver kan modellen romlige svar på målrettet terapi, midt narkotika behandlinger forblir kort (24 timer) og er iverksatt på utbruddet av dyrking26. Følgende protokollen beskriver viktig validering aspekter relevant for etablering og analyse av tumor skive kulturer, før deres anvendelse i farmakologiske narkotikatesting.
Ulike komplekse i vitro svulst modeller, inkludert 3D kulturer og organoids, har blitt utviklet for å recapitulate arkitekturen og kreftfremkallende funksjoner i vivo tumor vev29,30. Etablering av 3D kulturer eller organoids innebærer imidlertid vev dissosiasjon og selektiv vekst av en enkelt celle type eller co kultur en velge få celletyper i et kunstig miljø. Som en konsekvens, fange slike modeller ufullstendig intricacies av svulst heterogenitet og svulst-stroma interaksjoner. Organotypic tumor skiver, derimot, opprettholder vev arkitektur og biologiske kompleksiteten i situ -svulsten uten omfattende manipulasjon. Denne evnen av vev skiver modell tumor celler i deres innfødt microenvironment gjengir dem spesielt attraktivt for prekliniske studier. Vi har tidligere rapportert en optimalisert arbeidsflyt for etablering og analyse av presisjonsstyrte kutte svulst skiver, og viste at, sammenlignet med filtrere støtter, en roterende inkubasjon enhet forbedre levedyktigheten til kortsiktige murine NSCLC skive kulturer25 , 31. men dyrking på roterende enheter er teknisk utfordrende og krever konstant overvåking. Her presenterer vi en protokoll for tumor vev slice generasjon og praktisk bruk av en roterende inkubasjon enhet for å kultur dem, samt medfølgende metoder for å overvåke evne til skiver for å fange i situ svulst biologi, en forutsetning før narkotika respons testing.
Flere kritiske trinn i protokollen sikre vev integritet og levedyktigheten til tumor skiver. Hvis normale lungevev omgir svulsten, kan vibratome generere skiver med inkonsekvente tykkelse eller skade sektorene, på grunn av forskjeller i tekstur og stivhet mellom normal og tumor vev. Det er derfor viktig å fjerne omkringliggende normal lungevev før svulsten kutting. Et annet viktig skritt er slicing tykkelsen, som skal være nøye optimalisert for hver vev. Videre, når skiver, er det kritisk at stykket er plassert ca midt i rutenettet for å sikre nøyaktig intermitterende dyppe i kultur medium og oksygen eksponering. Endelig er det viktig å følge plasseringen av et stykke i sin rotasjon perioden som en skive kan falle ned i til medium; Hvis dette skjer, kan ytterligere handlinger tas som forklart i trinn 3.6 i protokollen.
I tillegg til vev håndtering for å sikre integritet, er det også avgjørende skritt i IHC analyse å tolke hvordan stykket ligner den opprinnelige vev. Vår forrige studie viste at murine NSCLC svulster ha uttalt intra-svulst romlige heterogenitet i kreftfremkallende signalnettverk aktiviteter26. Dette betyr at bruken av romlig forskjellige vev skiver for kontroller eller narkotika-behandlet prøver kan påvirke pålitelig prøvedata tolkning, og derfor tett tilstøtende stykker bør brukes som kontroller og test prøver. Vi ytterligere viste at mens spredning eller kreftfremkallende fosfoprotein som uttrykk i fersk kuttet uncultured 0t skiver var lik i situ svulster, kultivert skiver viste endret kreftfremkallende fosfoprotein som uttrykk, spesielt endret p4EBP1 og pSRC, samt endret spredning analysert av Ki67 IHC. Endret p4EBP1 uttrykk var tilsvarende funnet i 24 menneskelige NSCLC og prostatakreft skjær kulturer (Narhi et al., utfyllende figur S3B-S3C, S5 og S7)26. Disse funnene støtter at sammenligning av kultivert skiver med sine nærmeste 0t uncultured skive er kritisk å vurdere bevaring av i situ svulst funksjoner i kulturperler skiver.
Til tross for bedre levedyktigheten til organotypic skiver25, finnes det begrensninger med rotator systemet i form av formalitetene. Plassere vev skiver på Titan rutenett er mer utfordrende enn for å filtrere setter og en roterende inkubasjon enhet ikke er tilgjengelig. Stillestående filteret støtter kan brukes som et alternativ, men i så fall bare luft-utsatt siden av skiver bør bli analysert, som luft-til-filter graderinger i levedyktighet og hypoksi målt ved HIF1α uttrykk dannes raskt i filter-støttet stykke kulturer (Davies et al., figur 5 og finne 7A-7B)25. Vi har videre vist at svulsten skive kulturer kan ha endret spredning og kreftfremkallende signalnettverk aktiviteter forhold til deres opprinnelige svulster26, muligens på grunn av sårhelende svar eller metabolske tilpasning sektorene å ex vivo kultur32. Selv om brutto morfologiske funksjoner i murine NSCLC svulstene ble opprettholdt i 72 h dyrking, kan kultur-indusert proliferativ endringer påvirke nøyaktig gradering dyrket sektorene. Dermed bør vev skiver bare brukes for kortsiktige funksjonelle studier.
Bruk av en roterende inkubasjon redder minst delvis intra-skive levedyktighet eller biomarkør uttrykk graderinger, spesielt i de første 24 timer av kultur. Når godkjent for integritet og funksjon, gir dette vev materiale for funksjonell studier, som narkotika behandlingsstudier. I tillegg til stoffet svar profilering, kan endret måluttrykk etter behandling også dra antistoff validering. Dette er spesielt relevant for påvisning av murine epitopes med musen monoklonale antistoffer, som dette pleier å gi høy flekker bakgrunn. I tillegg må godt validert antistoffer oppnå pålitelige og reproduserbar data i diagnostiske og klinisk. Dermed gir modulering av overflod eller fosforylering av relevante epitopes etter behandling i vev skiver en hendig praktisk anvendelse i antistoff validering. En stor fordel av svulst skive kulturer er evnen til modell romlig-distribuert funksjoner, inkludert kreftfremkallende signalnettverk aktiviteter eller narkotika-respons i svulst eller stromal celler, som gjør dem en attraktiv ex vivo -modell. Imidlertid skiver rotere under dyrking, og prosessen med dyrking kan ytterligere skade vevet spesielt langs kantene. Det er derfor utfordrende nettopp overlappingen biomarkør-farget IHC bilder av 0t skiver med nekrotisk regionene i kulturperler skiver, som kompromitterer evnen til å nøyaktig link romlige biomarkør aktiviteter til narkotika-respons. I tillegg er svulst-innebygde, kultur-indusert og narkotikainduserte nekrotisk svar utvisket minst i murine NSCLC vev skiver, at nøyaktig kvantifisering av romlige narkotika svar. Til slutt, bruk av svulst skive kulturer tillater forsker på prøve flere forbindelser på samme svulst, uten å måtte behandle dyr, dermed raffinering, redusere og erstatte eksperimenter på forsøksdyr.
Som et fremtidig program, kan beskrevet protokollen vedtas klinisk solid tumor smakebiter. Videre er vev Typeavhengige endringer eller optimaliseringer trolig nødvendig, starter med justeringer vibratome innstillingene inkludert skive tykkelse og vibrasjon fart å optimalisere disse for svulst tekstur eller stivhet. I tillegg kan næringsstoffer og vekstfaktor krav variere for forskjellige tumor vev. Som et eksempel, har bryst kreft stykker vært kultivert med insulin supplert i middels13,18. Gitt at begrenset vev materiale er innhentet under operasjon eller biopsi, kan optimalisering av pasient-avledede svulst skive kulturer være utfordrende på grunn av problemer med å skaffe tilstrekkelig antall Repliker prøver. Videre er data reproduserbarhet også utfordret uttales pasient til pasient eksempel heterogenitet, spesielt i prosent for kreftceller versus fibrotiske regioner eller stromal infiltrerer, i tillegg til nekrotisk vev komponenter. Til slutt, anvendelse av svulst sektorer i diagnoseinnstillinger krever Gransking av omfanget hvilket svar i sektoren explants av forbehandling biopsier kamper etter behandling i vivo svar.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning arbeid mottatt økonomisk støtte fra nyskapende medisiner initiativ felles foretak gi avtalen no 115188, Universitetet i Helsinki Doctoral programmet i biomedisin stipend (A.S.N.) og Sigrid Juselius og Orion-Farmos stiftelser (E.W.V.). Vi oppriktig takke våre PREDECT vev slice plattform consortium medlemmer (Taija af Hällström og Siv Knaappila for støtte i å sette opp rotator systemet, og Riku Turkki for støtte med MATLAB analyse. Jouko Siro er takket for å fange figur 1 fotografiene. Vi takker FIMM WebMicroscope laget for skanning histologiske lysbilder, og laboratoriet dyr senter for dyrehold støtte.
Hank’s Balanced salt solution (HBSS) | Sigma | H6648 | |
Penicillin Streptomycin solution | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | |
Ham's F-12 medium | Thermo Fischer Scientific | 21765-037 | |
Glucose | VWR | 101174Y | |
FBS | Thermo Fischer Scientific | 10270-106 | |
Glutamine 200mM | Thermo Fischer Scientific | 25030-024 | |
Cyanoacrylate adhesive (GLUture) | Abbott | 32046-90-1 | |
Leica VT1200 S vibrating blade microtome | Leica Biosystems | 14048142066 | |
Slicing blade | VWR | PERS60-0138 | |
Titanium grids | Albamma Research and Development | MA0036 | |
Slice incubation unit | Albamma Research and Development | MD2500 | |
10 cm tissue culture plate | Sarstedt | 83.1802 | |
24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
6-well plate | Sarstedt | 83.1839 | |
Neolus Hypodermic Needles | Terumo Neolus | NN2525R | |
50 mL falcon tube | Greiner | 227261 | |
PBS | Lonza | BE17-517Q | |
Formaldehyde | Fisher | F/1501/PB08 | |
Trifold histo cassette paper | Cancer Diagnostics | DX26280 | |
Histo cassettes | VWR | 720-2199 | |
KOS The microwave multifunctional tissue processor | Milestone SRL | CAT307EN-003 | |
Microtome | Thermo Fischer Scientific | HM355S | |
Superfrost Ultra plus slides | VWR | 631-0099 | |
BSA | Sigma | A2153 | |
NGS | Thermo Fischer Scientific | 16210-064 | |
Citric acid | Sigma | C1909 | |
PT-Module | Thermo Fischer Scientific | A80400012 | |
Hematoxylin for H&E staining | Merck | 1.09249.0500 | |
Hematoxylin for counter staining | Dako | S3309 | |
Eosin | Sigma | E4382 | |
NKX2-1 antibody | Abcam | ab133638 | Lot Number: GR98031-12 |
pERK 1/2 antibody | Cell Signaling Technologies | CST 4370 | Lot Number: 17 |
p4EBP1 antibody | Cell Signaling Technologies | CST 2855 | Lot Number: 20 |
BrightVision poly-HRP Goat anti-rabbit secondary antibody | ImmunoLogic | VWRKDPVR-110HRP | |
Mounting medicum pertex | VWR | MEDT41-4021-00 | |
DAB | ImmunoLogic | VWRKBSO4-110 | |
Dactolisib (NVP BEZ-235) | Selleckchem | S1009 | |
Selumetinib (AZD2644) | Selleckchem | S1008 | |
Pannoramic 250 slide scaner | 3DHISTECH | ||
MATLAB | MathWorks | https://se.mathworks.com/products/matlab.html | |
3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER | 3DHISTECH | https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer | |
Adobe Photoshop CS6 | Adobe | https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&mv=search&s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s | |
Fiji-ImageJ | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | |
CellProfiler | CellProfiler cell image analysis software | http://cellprofiler.org/ |