HuVEC Analisi della formazione di tubi per valutare l'impatto dei prodotti naturali sull'angiogenesi

Summary

Qui, valutiamo gli effetti dell’estratto d’acqua dei tombolens di Ruta sulla formazione della rete navale utilizzando un saggio di formazione del tubo su una matrice sotterranea gelata.

Abstract

L’angiogenesi è un fenomeno che comprende diversi processi, come la proliferazione delle cellule endoteliali, la differenziazione e la migrazione, che portano alla formazione di nuovi vasi sanguigni e coinvolgono diversi percorsi di trasduzione del segnale. Qui dimostriamo che il test di formazione dei tubi è un semplice metodo in vitro per valutare l’impatto dei prodotti naturali sull’angiogenesi e per studiare i meccanismi molecolari coinvolti. In particolare, in presenza dell’estratto d’acqua di Ruta graveolens (RGWE), le cellule endoteliali non sono più in grado di formare una rete cellulare e che gli effetti di RGWE sulla formazione di tubi endoteliali delle cellule ombelicali umane (HUVEC) sono aboliti attivazione coniugale di MEK.

Introduction

L’angiogenesi è un processo fisiologico che porta alla formazione di nuovi vasi sanguigni da quelli preesistenti e si verifica durante l’embriogenesi e la crescita degli organi. In età adulta, l’angiogenesi si attiva solo nell’ovaia ciclistica, nella placenta durante la gravidanza e durante la guarigione e la riparazione della ferita. L’angiogenesi dipende dalla capacità delle cellule endoteliali di proliferare, differenziare e migrare per formare una rete vascolare intatta¹. Tuttavia, in diversi disturbi, come le malattie infiammatorie, metaboliche e reumatiche, i processi angiogenici sono alterati e l’angiogenesi diventa eccessiva. Inoltre, i processi angiogenici incontrollati stimolano anche la progressione del tumore e la metastasi¹. Per questi motivi, nell’ultimo decennio, gli studi di ricerca si concentrano sullo sviluppo di nuove strategie terapeutiche volte all’inibizione dell’eccessiva angiogenesi nei disturbi del cancro, oculare, articolare o della pelle^2,3.

Il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) rappresenta l’obiettivo principale delle attuali terapie antiangiogeniche⁴e sono stati sviluppati e sintetizzati diversi anticorpi monoclonali anti-VEGF per prevenire l’eccessiva angiogenesi. Tuttavia, queste droghe sintetiche mostrano gravi effetti collaterali e hanno un rapporto costo-beneficio sfavorevole^5,6. Pertanto, è imperativo trovare nuove strategie terapeutiche per limitare l’angiogenesi eccessiva con effetti collaterali minimi per integrare e combinare con farmaci attualmente utilizzati. Questi nuovi farmaci possono essere trovati tra i prodotti naturali che sono caratterizzati da un’elevata diversità chimica e specificità biochimica.

In questo articolo, proponiamo un metodo semplice per valutare l’impatto del RGWE sulla capacità degli HUVEC di formare tubuli su una matrice sotterranea gelata in vitro⁵. Infatti, RGWE è una miscela di metaboliti secondari come flavonoidi e polifenoli tra i quali la rutina è il componente principale⁵. Molti di loro sono già stati testati come agenti anti-infiammatori e vasoprotettivi^7,8,9,10,11. Inoltre, abbiamo recentemente dimostrato che RGWE, ma non la rutina, è in grado di inibire la capacità HUVEC di formare tubuli su una matrice sotterranea gelata e che questo fenomeno è mediato dal percorso MEK-ERK, indicando RGWE come un potenziale strumento terapeutico in grado di prevenire l’eccessiva formazione di nuovi vasi sanguigni⁵.

Protocol

1. Preparazione RGWE Raccogliere le foglie di R. graveolens dalle piante durante i mesi primaverili / estivi sotto la supervisione di un botanico. NOT:</ In questo caso, le foglie sono state raccolte presso la Sezione Sperimentale di Piante Medicinali nell’Oro Botanico di Napoli, Italia5. La pianta è spontanea, perenne ed è presente nelle regioni mediterranee (Figura1). Pesare 250 g di foglie e tritarle finement…

Representative Results

Per valutare l’influenza di RGWE sull’angiogenesi, abbiamo eseguito un test di formazione di tubi su una matrice del seminterrato gelata. Quando vengono coltivati su di esso, gli HUVEC formano strutture simili a tubi che provengono da cellule che appaiono allungate e che si collegano tra loro per formare una rete cellulare (Figura 2). Nella Figura 3, si mostra che il numero di filiali in HUVEC trattati con RGWE è stato significa…

Discussion

I composti naturali sono caratterizzati da un’elevata diversità chimica e specificità biochimica e rappresentano una fonte di molecole potenzialmente terapeutiche. Qui, mostriamo come ottenere l’estratto d’acqua dalla pianta R. graveolens e proponiamo il saggio di formazione dei tubi come un metodo facile da eseguire, affidabile e quantitativo utile per studiare gli effetti di RGWE sull’angiogenesi. È importante far bollire le foglie di R. graveolens per 1 h per essere sicuri di ottenere l’estratto d…

Materials

HUVEC cells	Clontech	C2519A
FBS	Invitrogen	10270106
EBM-2 basal medium	Clontech	cc3156
Single quot kit- supplemets and growth factors	clontech	cc4147
Matrigel	Corning	354234
96-well plates	Thermo Scientific	167008
15 mL conical tubes	Sarstedt	62,554,502
10 mL disposable serological pipette	Sarstedt	861,254,001
5 mL disposable serological pipette	Sarstedt	861,253,001
1000 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
100 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
20 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
p1000 pipette tips	Sarstedt
p20-200 pipette tips	Sarstedt	70,760,502
Burker chamber	Fortuna
Trypan blu stain	Gibco	15250-061
DPBS	Gibco	14190-094
mill-ex 0.22 um filters	Millipore	SLGS033SS
Lyophilizer	VirTis-SP Scientific
Incubator	Thermo Scientific
CO2	AirCos
Pen-Strep	Gibco	15070-063
100 mm dish	Sarstedt	833,902
pcDNA3	Invitrogen	v79020
Lipofectamine-2000	Invitrogen	11668027
Opti-MEM	Gibco	31985070	Reduced serum medium
Rutin	Sigma-Aldrich	R5143-50G
Axiovert 25 microscope	Zeiss
AmScope MD500 camera	AmScope
Dispase	Thermo Scientific	D4818
Lab heater	Falc
ParaFilm	American National Can