HUVEC-buis-formatie test om de impact van natuurlijke producten op angiogenese te evalueren
Summary
Hier evalueren we de effecten van het water extract van Ruta graveolens op de vorming van een vat netwerk door gebruik te maken van een buis vormings test op een opgestijfde kelder matrix.
Abstract
Angiogenese is een fenomeen dat verschillende processen omvat, zoals de proliferatie van endotheliale cellen, differentiatie en migratie, die leiden tot de vorming van nieuwe bloedvaten en betrekking hebben op verschillende signaaltransductie trajecten. Hier tonen we aan dat de buis vormings test een eenvoudige in vitro methode is om de impact van natuurlijke producten op angiogenese te evalueren en om de betrokken moleculaire mechanismen te onderzoeken. In het bijzonder, in de aanwezigheid van het water extract van Ruta graveolens (rgwe), zijn endotheelcellen niet langer in staat om een cel-celnetwerk te vormen en dat de rgwe-effecten op menselijke navelstreng ader endotheliale cel (huvec) buis vorming wordt afgeschaft door de constitutieve activering van MEK.
Introduction
Angiogenese is een fysiologisch proces dat leidt tot de vorming van nieuwe bloedvaten van bestaande en treedt op tijdens embryogenese en orgel groei. In de volwassenheid wordt angiogenese alleen geactiveerd in de fiets-eierstok, in de placenta tijdens de zwangerschap en tijdens wondgenezing en-herstel. Angiogenese is afhankelijk van het vermogen van endotheel cellen om te vermenigvuldigen, te differentiëren en migreren naar een intact vasculaire netwerk vormen1. Echter, in verschillende aandoeningen, zoals inflammatoire, metabole, en reumatische aandoeningen, angiogene processen worden gewijzigd en angiogenese wordt overmatig. Bovendien stimuleren ongecontroleerde angiogene processen ook de progressie van de tumor en metastasen1. Om deze redenen, in de afgelopen tien jaar, onderzoeken zijn gericht op de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën gericht op de remming van overmatige angiogenese in Cancer, oculaire, gewricht, of huidaandoeningen2,3.
Vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) vertegenwoordigt het belangrijkste doelwit van huidige antiangiogenic therapieën4, en verschillende anti-VEGF monoklonale antilichamen zijn ontwikkeld en gesynthetiseerd om overmatige angiogenese te voorkomen. Echter, deze synthetische drugs vertonen ernstige bijwerkingen en hebben een ongunstige kosten/batenverhouding5,6. Daarom is het noodzakelijk om nieuwe therapeutische strategieën te vinden om buitensporige angiogenese met minimale bijwerkingen te vullen en te combineren met momenteel gebruikte drugs. Deze nieuwe geneesmiddelen kunnen worden gevonden onder natuurlijke producten die worden gekenmerkt door een hoge chemische diversiteit en biochemische specificiteit.
In dit artikel stellen we een eenvoudige methode voor om de impact van de rgwe te evalueren op het vermogen van huvecs om tubuli te vormen op een opgestijfde-kelder matrix in vitro5. Inderdaad, RGWE is een mengsel van secundaire metabolieten zoals flavonoïden en polyfenolen, waaronder rutine is de belangrijkste component5. Velen van hen zijn al getest als anti-inflammatoire en vasoprotective agenten7,8,9,10,11. Bovendien hebben we onlangs aangetoond dat rgwe, maar niet rutin, in staat is om het huvec-vermogen te remmen om tubuli te vormen op een opgestijfde-kelder matrix en dat dit fenomeen wordt gemedieerd door de MEK-ERK-route, wat rgwe aangeeft als een potentieel therapeutisch instrument dat in staat is om Voorkom overmatige nieuwe bloedvat vorming5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Natuurlijke verbindingen worden gekenmerkt door een hoge chemische diversiteit en biochemische specificiteit en vertegenwoordigen een bron van potentieel therapeutische moleculen. Hier laten we zien hoe we water extract van de plant R. graveolens kunnen verkrijgen en de buis vormings test voorstellen als een eenvoudig te vervullen, betrouwbare en kwantitatieve methode die nuttig is om de effecten van rgwe op angiogenese te onderzoeken. Het is belangrijk om de R. graveolens bladeren te koken voor 1 uur o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door Fondi di Ateneo aan Luca Colucci-D’Amato en VALERE Program funds aan Maria Teresa Gentile en AIRC Fund IG18999 aan Maurizio Bifulco.
Materials
| HUVEC cells | Clontech | C2519A | |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | |
| EBM-2 basal medium | Clontech | cc3156 | |
| Single quot kit- supplemets and growth factors | clontech | cc4147 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| 96-well plates | Thermo Scientific | 167008 | |
| 15 mL conical tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| 10 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,254,001 | |
| 5 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,253,001 | |
| 1000 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 100 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 20 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| p1000 pipette tips | Sarstedt | ||
| p20-200 pipette tips | Sarstedt | 70,760,502 | |
| Burker chamber | Fortuna | ||
| Trypan blu stain | Gibco | 15250-061 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| mill-ex 0.22 um filters | Millipore | SLGS033SS | |
| Lyophilizer | VirTis-SP Scientific | ||
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| CO2 | AirCos | ||
| Pen-Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 100 mm dish | Sarstedt | 833,902 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | v79020 | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Rutin | Sigma-Aldrich | R5143-50G | |
| Axiovert 25 microscope | Zeiss | ||
| AmScope MD500 camera | AmScope | ||
| Dispase | Thermo Scientific | D4818 | |
| Lab heater | Falc | ||
| ParaFilm | American National Can |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).
- Ferrara, N., Kerbel, R. S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).
- Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).
- Gentile, M. T., et al. Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway. Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).
- Butler, M. S. Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials. Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).
- Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. Natural product inhibitors of ocular angiogenesis. Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).
- Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
- Trung, N. X. In vitro models for angiogenesis. Journal of Science & Development. 13 (4), 850-858 (2015).
- Ucuzian, A. A., Greisler, H. P. In vitro Models of Angiogenesis. World Journal of Surgery. 31, 654-663 (2007).
- Simons, M., et al. American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).
- DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).
