हम एक पूरा विवर्तन डेटा सेट प्राप्त करने के लिए, अनुवर्ती संरचना निर्धारण में उपयोग के लिए, आंशिक द्विवर्तन डेटा फ्लोरोसेंट प्रोटीन सेरुलियन के कई छोटे क्रिस्टल से एकत्र सेट से बना meshandcollect प्रोटोकॉल का उपयोग वर्तमान ।
एक्स-रे क्रिस्टलीय प्रमुख तकनीक जैविक macromolecules के 3 आयामी संरचनाओं के विषय में उच्च संकल्प जानकारी प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है । हाल ही में जब तक, एक प्रमुख आवश्यकता अपेक्षाकृत बड़े, अच्छी तरह से diffracting क्रिस्टल, जो अक्सर प्राप्त करने के लिए चुनौतीपूर्ण है की उपलब्धता रहा है । हालांकि, धारावाहिक क्रिस्टलीय के आगमन और बहु में एक पुनर्जागरण-क्रिस्टल डेटा संग्रह विधियों का मतलब है कि बड़े क्रिस्टल की उपलब्धता अब एक सीमित कारक होना चाहिए । यहां, हम स्वचालित MeshAndCollect प्रोटोकॉल है, जो पहले कई छोटे क्रिस्टल की स्थिति की पहचान एक ही नमूना धारक पर घुड़सवार के उपयोग को समझाने और फिर के लिए आंशिक भिंन डेटा सेट की एक श्रृंखला के क्रिस्टल से संग्रह निर्देश अनुवर्ती विलय और संरचना निर्धारण में उपयोग करें । MeshAndCollect माइक्रो क्रिस्टल के किसी भी प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है, भले ही कमजोर डिफफ्रैक्टिंग । एक उदाहरण के रूप में, हम यहां पेश करने के लिए तकनीक का उपयोग करने के लिए Cyan फ्लोरोसेंट प्रोटीन की क्रिस्टल संरचना (CFP) सेरुलियन हल ।
Macromolecular एक्स-रे क्रिस्टललेखी (MX), दूर से, जैविक macromolecular के तीन आयामी संरचनाओं में परमाणु संकल्प अंतर्दृष्टि पाने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधि है । हालांकि, एक प्रमुख बोतल गर्दनें अपेक्षाकृत बड़े, अच्छी तरह से डिफफ्रैक्टिंग क्रिस्टल के लिए आवश्यकता है ।
अक्सर, और विशेष रूप से जब झिल्ली प्रोटीन क्रिस्टलीकरण, सबसे बड़ा आयाम में कुछ माइक्रोन के केवल बहुत छोटे क्रिस्टल प्राप्त किया जा सकता है । विकिरण क्षति प्रभाव एक पूर्ण विवर्तन डेटा सेट है कि एक एकल माइक्रो क्रिस्टल2से एकत्र किया जा सकता है के संकल्प की सीमा, और बहुत बार, यह शोर अनुपात करने के लिए संकेत में सुधार करने के लिए आवश्यक है और इसलिए डेटा सेट संकल्प, कई विलय द्वारा आंशिक अलग से डेटा सेट, लेकिन समरूपी क्रिस्टल । सिंक्रोट्रॉन स्रोतों और कहीं पर एक्स-रे बीम के फ्लक्स घनत्व में वृद्धि ( एक्स-रे मुक्त इलेक्ट्रॉन लेजर्स (एक्स-fels)), मतलब है कि उपयोगी आंशिक विवर्तन डेटा सेट जैविक के भी बहुत छोटे क्रिस्टल से एकत्र किया जा सकता है अणुओं. यह, बारी में, संग्रह और आंशिक विवर्तन डेटा के विलय के लिए नई तकनीकों के विकास के लिए नेतृत्व किया गया है कई अलग क्रिस्टल से एकत्र की संरचना समाधान के लिए एक पूरा डेटा सेट का उत्पादन करने के क्रम में । ऐसी तकनीकों को सामान्यतः धारावाहिक क्रिस्टललेखी (SX)3,4,5,6,7,8के रूप में संदर्भित किया जाता है । एसएक्स का एक प्रोटोटाइप उदाहरण एक्स-रे बीम3,4,5में एक क्रिस्टल घोल की एक संकीर्ण धारा शुरू करने के लिए सुई लगानेवाला उपकरणों का उपयोग है । एक विवर्तन पैटर्न हर बार रिकॉर्ड किया जाता है एक क्रिस्टल एक्स-किरणों को उजागर करने के लिए अग्रणी है संग्रह करने के लिए, व्यक्तिगत क्रिस्टल के कई हजारों से, ‘ अभी भी ‘ विवर्तन छवियों, जानकारी है जो फिर एक पूरा डेटा सेट का उत्पादन करने के लिए विलय कर दिया है । हालांकि, धारावाहिक डेटा संग्रह के इस प्रकार का एक काफी नुकसान है कि अभी भी छवियों के प्रसंस्करण समस्याग्रस्त किया जा सकता है । आंकड़ों की गुणवत्ता में काफी सुधार हुआ है यदि क्रिस्टल घुमाया जा सकता है और/सीरियल क्रिस्टलीय प्रयोगों6के दौरान एक ही क्रिस्टल से कई डिफक्शन छवियों एकत्र कर रहे हैं ।
MeshAndCollect1 ‘ मानक ‘ एमएक्स रोटेशन डेटा संग्रह के साथ एसएक्स के संयोजन के उद्देश्य के साथ विकसित किया गया था और अनुमति देता है, एक स्वचालित फैशन में, एक ही macromolecular लक्ष्य के कई क्रिस्टल से आंशिक डिफक्शन डेटा सेट इकट्ठा करने के लिए experimenters एक ही या अलग नमूना धारकों पर घुड़सवार । एक पूर्ण विवर्तन डेटा समुच्चय तब एकत्र किए गए आंशिक डेटा समुच्चयों के अधिकांश समरूपी विलयन द्वारा प्राप्त किया जाता है । meshandcollect एमएक्स के लिए किसी भी राज्य के-the-कला सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे बीमलाइन के साथ संगत है (आदर्श रूप में नमूना स्थिति पर एक अपेक्षाकृत छोटे (20 μm या कम) बीम आकार के साथ एक प्रविष्टि डिवाइस सुविधा). लघु के एक श्रृंखला से पूरा डेटा सेट के संकलन के अलावा, अच्छी तरह से diffracting क्रिस्टल, विधि भी बहुत सूक्ष्म क्रिस्टल के difअपवर्तन गुणवत्ता के प्रारंभिक प्रयोगात्मक मूल्यांकन के लिए उपयुक्त है और अपारदर्शी नमूनों के प्रसंस्करण के लिए, उदाहरण के लिए, मेसो में झिल्ली प्रोटीन के microक्रिस्टलों9।
एक MeshAndCollect प्रयोग के शुरू में, पदों, दो आयामों में, एक ही नमूना धारक में निहित कई क्रिस्टल में से प्रत्येक के एक कम खुराक एक्स-रे स्कैन का उपयोग कर निर्धारित कर रहे हैं । इस स्कैन के दौरान एकत्र द्विवर्तन छवियों को स्वचालित रूप से प्रोग्राम DOZOR1, जो नमूना धारक पर क्रिस्टल की स्थिति उनके संबंधित अलग अलग शक्ति के अनुसार प्रकार द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं । आंशिक डेटा सेट के संग्रह के लिए स्थितियां स्वचालित रूप से एक विवर्तन शक्ति कट-ऑफ़ के आधार पर असाइन की जाती हैं और अंतिम चरण में, विवर्तन डेटा के छोटे wedges, सामान्यतया ± 5 का ° रोटेशन, प्रत्येक चुनी गई स्थिति से एकत्रित किए जाते हैं. अनुभव से पता चला है कि इस रोटेशन रेंज आंशिक डेटा के लिए क्रिस्टल प्रति प्रतिबिंब की एक पर्याप्त राशि प्रदान करता है स्केलिंग प्रयोजनों के सेट, जबकि एक ही समय में, संभव को कम करने के क्रिस्टल केंद्रित मुद्दों और एक में कई क्रिस्टल को उजागर करने का मौका विशेष रूप से भीड़ समर्थन1। इसके बाद व्यक्तिगत रूप से या तो मैन्युअल रूप से या स्वचालित डेटा प्रोसेसिंग पाइपलाइन10,11,12,13का उपयोग कर संसाधित कर रहे हैं । डाउनस्ट्रीम संरचना निर्धारण के लिए यह तो14,15,16 विलय किया जा करने के लिए आंशिक डेटा सेट का सबसे अच्छा संयोजन खोजने के लिए आवश्यक है जिसके बाद परिणामस्वरूप पूरा डेटा सेट उसी तरह से इलाज किया जा सकता है एक एकल क्रिस्टल प्रयोग से उद्भव के रूप में ।
व्यवहार में meshandcollect का एक उदाहरण के रूप में, हम यहां cyan फ्लोरोसेंट प्रोटीन (cfp) cerulean के क्रिस्टल संरचना का समाधान वर्तमान, एक की श्रृंखला से एकत्र आंशिक डेटा सेट के संयोजन से निर्मित एक विवर्तन डेटा सेट का उपयोग एक ही नमूना समर्थन पर घुड़सवार माइक्रोक्रिस्टल । सेरुलियन जेलिफ़िश aequorea विक्टोरिया17से हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) से इंजीनियर किया गया है, जिसका फ्लोरोसेंट वर्णमूलक autoउत्प्रेरक तीन लगातार अमीनो एसिड अवशेषों के चक्रीकरण से बना है । सेरुलियन, क्रोमोफोर, सेरीन और टाइरोसीन के पहले और दूसरे अवशेषों को क्रमशः थ्रिटोनिन (S65T) और ट्रिप्टोफेन (Y66W) के रूप में रूपांतरित करके जीएफपी से प्राप्त किया जाता है और इसके आगे के उत्परिवर्तनों के साथ क्रोमोफोर वातावरण को अनुकूल (Y145A, N146I, H148D, M153T और V163A) का उत्पादन करने के लिए एक महत्वपूर्ण, अभी तक सबऑप्टिमल प्रतिदीप्ति स्तर qy = ०.४९18,19,20। सेरुलियन के सबऑप्टिमल फ्लोरोसेंट गुणों को जटिल प्रोटीन गतिशीलता से जोड़ने का प्रस्ताव किया गया है, जिसमें प्रोटीन की ग्यारह β-किस्में में से एक के अपूर्ण स्थिरीकरण और दो भिन्न क्रोमोफोर के आवास को शामिल किया गया है । आइसोमर पीएच और विकिरण की स्थिति22पर निर्भर करता है । हम एक मॉडल प्रोटीन के रूप में Cerulean के साथ काम करने के लिए चुना क्रिस्टल आकार ट्यूनिंग क्रिस्टलीकरण के आधार पर अपेक्षाकृत आसानी के कारण MeshAndCollect प्रोटोकॉल का उपयोग illustrating । सेरुलियन की संरचना बहुत ही अपने मूल प्रोटीन जीएफपी के समान है, क्योंकि यह एक β-बैरल का गठन एक α-हेलिक्स, जो क्रोमोफोर भालू के आसपास ग्यारह β-किस्में का गठन किया है ।
एक MX प्रयोग की सफलता आमतौर पर अपेक्षाकृत बड़े, अच्छी तरह से diffracting क्रिस्टल के अस्तित्व पर निर्भर करता है । परियोजनाओं के लिए जहां छोटे क्रिस्टल बौछार से बड़े क्रिस्टल के लिए अनुकूलन विफल रहता है, MeshAndCollect एक संभावना प्रदान करता है एक पूर्ण विवर्तन डेटासेट प्राप्त करने के लिए संरचना समाधान के संयोजन के माध्यम से समरूपी आंशिक डाटा सेट एकत्र छोटे क्रिस्टल की एक श्रृंखला से । विधि एक उच्च फोटॉन प्रवाह और एक छोटे बीम व्यास, कला विवर्तनमापी डिवाइस और एक तेजी से readout डिटेक्टर के एक राज्य के साथ सुसज्जित के साथ, आदर्श MX के लिए सिंक्रोट्रॉन बीएमलाइंस के साथ संगत है । इस तरह के एक अंत स्टेशन पर, इस तरह के एक प्रयोग के डेटा संग्रह भाग के बारे में 20 मिनट लगेंगे, एकत्र किए जाने वाले आंशिक डेटा सेट की संख्या और विश्लेषण किए जाने वाले क्रिस्टल-युक्त नमूना धारकों की संख्या के आधार पर होगा ।
एक MeshAndCollect प्रयोग की सफलता के लिए सबसे महत्वपूर्ण पूर्वावश्यकता एक पर्याप्त संख्या का अस्तित्व है (कम से ५०, १०० आदर्श रूप में) नमूना धारक पर स्थिति का डिफफ्रैक्टिंग । अनुभव से, क्रिस्टल के ंयूनतम आकार का विश्लेषण किया जा करने के लिए सबसे छोटी आयाम में के बारे में 5 μm होना चाहिए । विधि मानक cryo के किसी भी प्रकार के साथ संगत है-सबसे अच्छा परिणाम मेष mounts कि कठोर और सीधे कर रहे है का उपयोग कर प्राप्त किया जा रहा है के साथ संगत नमूना धारकों ठंडा ।
esrf में, meshandcollect एक passerelle में उपयोगकर्ता के अनुकूल तरीके से लागू किया जाता है (http://isencia.be/passerelle-edm-en) कार्यप्रवाह30 MXCuBE2 बीमलाइन नियंत्रण सॉफ्टवेयर से उपलब्ध है । अंय एसएक्स विधियों की तुलना में MeshAndCollect का एक प्रमुख लाभ यह है कि एकत्र डेटा मानक कार्यक्रमों और स्वचालित एकल क्रिस्टल एमएक्स के लिए इस्तेमाल पाइपलाइनों द्वारा संसाधित किया जा सकता है ।
जैसा कि हमारे उदाहरण से पता चलता है, MeshAndCollect बहुत लागू करने के लिए आसान है और आंशिक विवर्तन डेटा सेट की एक श्रृंखला की ओर जाता है, आमतौर पर छोटे क्रिस्टल से एकत्र, जो संरचना समाधान में उपयोग के लिए एक पूर्ण डेटा सेट का उत्पादन करने के लिए विलय किया जा सकता है । इसके अलावा, MeshAndCollect को प्रोटीन क्रिस्टलग्राफी के नमूने अंतरिक्ष खोलने की क्षमता है के रूप में यह एक तरह से क्रिस्टलीकरण परीक्षण जहां पिछले अनुकूलन कदम, बड़े क्रिस्टल का उत्पादन, असफल से प्रयोग करने योग्य डेटा एकत्र प्रदान करता है ।
उज्ज्वल एक्स-रे स्रोतों की दिशा में वर्तमान घटनाक्रम के प्रकाश में (जैसे, अत्यंत शानदार स्रोत (ईबीएस) परियोजना/यह निकट हैकि विकिरण क्षति की वृद्धि के कारण, मल्टी-क्रिस्टल डेटा संग्रह की सुविधा के प्रकार द्वारा MeshAndCollect डेटा संग्रह के मानक विधि बन जाएगा, बजाय एक अपवाद-के रूप में वर्तमान में मामला है-synchrotron पर आधारित एमएक्स beamlines ।
The authors have nothing to disclose.
हम अपने घर में अनुसंधान कार्यक्रम के माध्यम से बीम समय प्रदान करने के लिए ESRF धंयवाद ।
Beamline | ESRF ID 23-1 | ||
Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K | Merck Millipore | UFC803024 | |
Crystallization plates XDXm with sealant | Hampton Research | HR3-306 | |
EDTA- free protease inhibitors | Roche | 4,693,159,001 | |
Escherichia coli BL21 (DE3) | Life Technologies Thermo Fisher Scientific | C600003 | |
glycerol | VWR Chemicals Prolabo | 14388.29T | |
HEPES | Euromedex | 10-110-C | |
His-trap HP | GE healthcare | 17-5247-01 | |
imidazole | Sigma-Aldrich | 56750-500G | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13452-1KG | |
MicroMeshes 700/25 | MiTeGen | SKU: M3-L18SP-25L | |
NaCl | Fisher Chemical | S/3160/60 | |
PEG8000 | Sigma-Aldrich | P5413-500G | |
Sonicator vibra cell 75/15 | SONICS | ||
Superdex 75 10/300 -GL | GE healthcare | 17-5174-01 | |
Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B | |
Trypsin | Sigma-Aldrich | T9201-1G | |
Unipuck | Molecular Dimensions | MD7-601 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Programs | |||
ISPyB | ESRF | Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186–3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535 | local development |
aimless | MRC Laboratory of Molecular Biology | Evans, P.R., Murshudov, G.N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204–1214, doi: 10.1107/S0907444913000061 (2013). | |
ccCluster | ESRF | Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844–1851, doi: 10.1107/S1600576717015229 (2017). | local development |
DOZOR | ESRF | Bourenkov and Popov, unpublished | local development |
MeshAndCollect workflow | ESRF | Zander, U. et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328–2343, doi: 10.1107/S1399004715017927 (2015). | local development |
MXCuBE2 | ESRF | Gabadinho, J. et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700–707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24–226 (2014). | local development |
XDS | Max-Planck-Institut für Medizinische Forschung | Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125–132, doi: 10.1107/S0907444909047337 (2010) |