समृद्ध और चुंबकीय नैनोकणों के साथ दुर्लभ प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं का विस्तार
Summary
प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं को अपने बेहद कम आवृत्ति के कारण चिकित्सा में विशेषता या उपयोग करने के लिए मुश्किल हैं । साथ ही, हम एक चुंबकीय कण जो प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं को इन कोशिकाओं को समृद्ध और फिर उंहें विस्तार करने के लिए कई सौ-लक्षण वर्णन और चिकित्सा के लिए गुना बांध कर सकते है विकसित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं ।
Abstract
हम दोनों को समृद्ध और प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए एक उपकरण विकसित किया है । यह ऐसे मामलों में मददगार हो सकता है जैसे A) antigen-विशिष्ट T कक्षों के अस्तित्व का पता लगाने, B) antigen-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं की गतिशीलता की जांच, C) कैसे antigen-विशिष्ट प्रतिसाद प्रतिरक्षा जैसे रोग स्थिति को प्रभावित कैसे समझते हैं, D) रहस्यमय नहीं रखना विषम antigen-विशिष्ट T कक्षों के लिए प्रतिसाद, या ई) antigen-विशिष्ट कक्षों का उपयोग चिकित्सा के लिए । उपकरण एक चुंबकीय कण है कि हम संयुग्मी प्रतिजन-विशिष्ट और टी सेल सह stimulatory संकेतों पर आधारित है, और है कि हम शब्द के रूप में कृत्रिम प्रतिजन कोशिकाओं (aAPCs) पेश । नतीजतन, चूंकि प्रौद्योगिकी के उत्पादन के लिए सरल है, यह आसानी से अंय प्रयोगशालाओं द्वारा अपनाया जा सकता है; इस प्रकार, हमारे यहां उद्देश्य के लिए विस्तार से निर्माण और aAPCs के बाद के उपयोग में वर्णन है । हम aAPCs के लिए antigen-विशिष्ट और सह-stimulatory संकेतों को अनुलग्न करने के लिए कैसे समझाते हैं, उंहें antigen-विशिष्ट t कक्षों के लिए समृद्ध करने के लिए उपयोग कैसे करें, और antigen-विशिष्ट t कक्षों का विस्तार कैसे करें । इसके अलावा, हम निस्र्पक प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के साथ हमारे अनुभव के प्रायोगिक और जैविक जानकारी के आधार पर इंजीनियरिंग डिजाइन विचार पर प्रकाश डाला जाएगा ।
Introduction
कई immunotherapies के उदय के साथ, वहां एक की जरूरत है करने के लिए विशेषताएं और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करने में सक्षम हो । विशेष रूप से, अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की वजह से कोशिकाओं की विशिष्टता और स्थायित्व की ब्याज की है । हाल ही में, chimeric-प्रतिजन-रिसेप्टर टी सेल चिकित्सा कैंसर चिकित्सा के लिए अनुमोदित किया गया है; हालांकि, antigen-रिसेप्टर्स सामांय कक्ष सतह antigen CD19, कैंसर1के लिए विशिष्ट एंटीजन के बजाय बंद आधारित हैं । विशिष्टता से परे, immunotherapies भी नियंत्रण की कमी से पीड़ित कर सकते हैं, और कैंसर या प्रतिरक्षा के भीतर गतिशील प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को समझने सीमित ।
antigen-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने की चुनौतियों में से एक उनके बहुत कम आवृत्ति है, जैसे, प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं प्रत्येक 104 से 106 टी कोशिकाओं2,3के 1 हैं । इस प्रकार, जो टी कोशिकाओं मौजूद है या जवाब की जांच करने के लिए, कोशिकाओं को या तो समृद्ध और विस्तार, या उनके संकेत को परिलक्षित होने की जरूरत है की जरूरत है । यह महंगा है और मौजूदा तकनीकों का उपयोग कर फीडर कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए मुश्किल है कि प्रतिजन-विशिष्ट कोशिकाओं के विस्तार पर ध्यान केंद्रित । वर्तमान तकनीक है कि प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के संकेत बढ़ाना पर ध्यान केंद्रित, एंजाइम से जुड़े immunospot (ELISPOT) परख की तरह, उन टी कोशिकाओं के पुनः उपयोग की सीमा4। अंत में, कम संवेदनशीलता के कारण, अक्सर इन दो तकनीकों antigen-विशिष्ट गणन के लिए संयोजित करने की आवश्यकता है ।
इन समस्याओं को हल करने के लिए, हम चुंबकीय nanoparticle-आधारित कृत्रिम antigen प्रस्तुत कक्ष (aAPC)5,6,7,8विकसित किया है । aAPC एक प्रतिजन-विशिष्ट संकेत-पेप्टाइड भरी हुई प्रमुख histocompatibility जटिल (pMHC) और सह stimulatory अणुओं-जैसे, एक विरोधी CD28 एंटीबॉडी-दोनों को समृद्ध प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के साथ कार्यात्मक किया जा सकता है और फिर बाद में उनके विस्तार को उत्तेजित (चित्रा 1) । कणों इस प्रकार एक लागत प्रभावी बंद-the-शेल्फ उत्पाद है कि दोनों प्रतिजन-विशिष्ट उत्तेजना अभी तक प्रयोगों और रोगियों में मानकीकृत को पूरा करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता हो सकता है । हजारों करने के लिए सैकड़ों में संवर्धन और विस्तार प्रक्रिया परिणाम प्रदर्शन प्रतिजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं का विस्तार गुना और आवृत्तियों में परिणाम कर सकते हैं ६० प्रतिशत तक सिर्फ एक सप्ताह के बाद, बड़े के लक्षण वर्णन या चिकित्सीय उपयोग को सक्षम करने कक्षों की संख्या । साथ ही, हम वर्णन कैसे nanoparticle aAPCs बनाने के लिए, nanoparticle गुणों को चुनने में कुछ महत्वपूर्ण डिजाइन विचार, और अलग और दुर्लभ प्रतिजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं के विस्तार में इन कणों के उपयोग से कुछ विशिष्ट परिणाम प्रदर्शित करता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम एक उपंयास प्रतिजन-विशिष्ट टी सेल अलगाव प्रौद्योगिकी nanoparticle कृत्रिम प्रतिजन पेश कोशिकाओं (aAPCs) पर आधारित बनाया है । Nanoparticle aAPCs की सतह पर पेप्टाइड-लोड MHC है जो antigen-विशिष्ट T कक्ष बाइंडिंग और सक्रियण को सह-stimulatory स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.W.H. धंयवाद NIH कैंसर नैनो NanoBioTechnology के लिए जॉंस हॉपकिंस संस्थान में प्रशिक्षण केंद्र, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन स्नातक रिसर्च फैलोशिप (डीजीई-१२३२८२५), और फैलोशिप समर्थन के लिए आर्क्स फाउंडेशन । यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से समर्थन द्वारा वित्त पोषित किया गया (P01-AI072677, R01-CA108835, R21-CA185819), TEDCO/मैरीलैंड नवाचार पहल, और कल्टर फाउंडेशन (JPS) ।
Materials
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 551263 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig | BD Biosciences | 551323 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 550750 | |
| Vivaspin 20 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932362 | |
| Vivaspin 2 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932257 | |
| Purified Human Beta 2 Microglobulin | Bio-Rad | PHP135 | |
| nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles | Micromod | 79-01-102 | |
| Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm | Ocean Nanotech | SN0200 | |
| Anti-Biotin MicroBeads UltraPure | Miltenyi | 130-105-637 | |
| EZ-Link NHS-Biotin | ThermoFisher | 20217 | |
| Sulfo-SMCC Crosslinker | ProteoChem | c1109-100mg | |
| 2-Iminothiolane hydrochloride | Sigma-Aldrich | I6256 Sigma | |
| 96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene | Corning | 3875 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain Clone R26-46 | BD Biosciences | 553434 | |
| FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG Clone G192-1 | BD Biosciences | 554026 | |
| B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice | Jackson Laboratory | 005023 | |
| C57BL/6J (B6 wildtype) mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse | Miltenyi | 130-104-075 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE | Biolegend | 405203 | |
| N52 disk magnets of 0.75 inches | K&J Magnetics | DX8C-N52 | |
| APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 | Biolegend | 100711 | |
| LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation | ThermoFisher | L-34969 |
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