Summary

Inrättande av Dual humanized TK-NOG musmodell för HIV-associerad lever patogenes

Published: September 11, 2019
doi:

Summary

Detta protokoll ger en tillförlitlig metod för att etablera humaniserade möss med både människans immunsystem och leverceller. Dubbla, rekonstituerade, immunotillräckliga möss som erhålls via intrasplenic injektion av humana hepatocyter och CD34+ hematopoietiska stamceller är mottagliga för humant immunbristvirus-1 infektion och recapitulate leverskada som observerats i HIV-infekterade patienter.

Abstract

Trots den ökade livslängden hos patienter infekterade med humant immunbristvirus-1 (HIV-1), leversjukdom har uppstått som en vanlig orsak till deras sjuklighet. Levern immunopatologi orsakad av HIV-1 förblir svårfångade. Små xenograft djurmodeller med mänskliga hepatocyter och humant immunförsvar kan recapitulate människans biologi av sjukdomens patogenes. Häri, ett protokoll beskrivs för att etablera en dubbel humaniserad musmodell genom mänskliga hepatocyter och CD34+ hematopoietiska Stem/progenitorceller (HSPCs) transplantation, att studera leverimmunopatologi som OBSERVERATS hos hiv-infekterade patienter. För att uppnå dubbel beredning, manliga TK-NOG (NOD. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Sug TG (ALB-tk) 7-2/shijic) möss injiceras intraperitonealt med ganciklovir (GCV) doser för att eliminera mus transgena leverceller, och med treosulfläkt för nonmyeloablativ konditionering, som båda underlätta humana hepatocyte (HEP) inympningoch människans immunsystem (hans) utveckling. Humant albumin (ALB) nivåer utvärderas för levertransplantation, och närvaron av mänskliga immunceller i blodet upptäcks av flödescytometri bekräftar inrättandet av människans immunsystem. Den modell som utvecklats med hjälp av det protokoll som beskrivs här liknar flera komponenter av leverskador från HIV-1-infektion. Dess etablering kan visa sig vara avgörande för studier av samtidig hepatitvirus-infektion och för utvärdering av antivirala och antiretrovirala läkemedel.

Introduction

Sedan tillkomsten av antiretroviral terapi, det har skett en betydande minskning av dödsfall i samband med HIV-1-monoinfektion. Emellertid, leversjukdom har uppstått som en vanlig orsak till sjuklighet hos hiv-infekterade patienter1,2. Infektioner av hepatitvirus med hiv-1-infektion är vanligare, står för 10%-30% av hiv-infekterade personer i USA3,4,5.

Värd-specificiteten av HIV-1 och hepatitvirus begränsar nyttan av små djurmodeller för att studera människospecifika infektionssjukdomar eller för att undersöka flera aspekter av HIV-1-associerad leverpatogenes. Möss med nedsatt immunförsvar som möjliggör en inympelse av mänskliga celler och/eller vävnader (s.k. humaniserade musmodeller) är acceptabla djurmodeller för prekliniska studier6,7,8. Sedan introduktionen av humaniserade möss i början av 2000-talet, flera prekliniska studier av kolestatisk Human levertoxicitet, Human-specifika patogener, inklusive HIV-1 och HIV-associerade neurokognitiva störningar, Epstein Barr-virus, hepatit och andra infektionssjukdomar, har undersökts i dessa möss6,9,10,11. Flera musmodeller för CD34+ hspcs och/eller Human hepatocyte transplantation har länge utvecklats och har förbättrats med tiden för att studera sjukdomens patogenes av hepatit B-virus (HBV)-associerad leversjukdom12, 13 , 14. flera modeller för HSPC och Human hepatocyte (HEP) transplantation baseras på stammar, känd som nog (nod. CG-prkdcscid Il2rgtm1Sug/jictac)8,13, NSG (nod. CG-prkdcscid Il2rgtm1Wjl/szj)15, Balb/C-Rag2-/- c-/- (Rag2TM 1.1 FLV Il2rgTM 1.1 FLV/j)12, och Fah-/- nod rag1-/- il2rγnull mus16. Men varje modell har sina egna fördelar och begränsningar; till exempel AFC8 dubbla humaniserade möss för heps och mänskliga stamceller (hscs) på en Balb/C-Rag2-/- c-/- bakgrund möjliggör en lyckad inympelse av immunceller och hscs, men det finns en avsaknad av en antigen-specifik T-och B-cell svar i denna modell12. Den stora oro för beredning av dubbla humaniserade möss inkluderar suboptimala engrafations, en brist på lämpliga modeller för att stödja olika vävnader, avvikande villkor, immun avvisande, eller graft-Versus-host sjukdom (GVHD), och tekniska svårigheter, såsom riskfyllda manipulationer med nyfödda och hög dödlighet på grund av metabola avvikelser13.

Även humaniserade möss har använts för hiv-forskning för många år17,18,19, användning av humaniserade möss för att studera leverskador orsakade av hiv-1 har varit begränsad20. Vi rapporterade tidigare inrättandet av en dubbel humaniserad TK-NOG musmodell och dess tillämpning i HIV-associerad leversjukdom8. Denna modell visar robust inympelse av lever och immunceller och recapitulates HIV-infektion patogenes. Denna diskussion presenterar ett detaljerat protokoll, inklusive de mest kritiska stegen i transplantation av humana hepatocyter. En beskrivning av HSPCs krävs för en lyckad inympningen av HEPs och inrättandet av ett funktionellt immunförsvar i TK-NOG möss presenteras också. Användningen av dessa möss för att studera HIV-associerad lever immunopathogenes är detaljerad. TK-nog manliga möss som transporterar en leverspecifik herpes simplex virus typ 1 tymidin Kinas (HSV-tk) transgenens används. Mus leverceller som uttrycker denna transgenens kan lätt ableras efter en kort exponering för en giftfri dos av GCV. Transplanterade humana leverceller upprätthålls stabilt inom musen levern utan EXOGEN droger21. Mössen är också konditionerade med nonmyeloablativa doser av treosulfläkt att skapa en nisch i musen benmärg för mänskliga celler8. Immunobristfällig TK-NOG möss är intrasplenically injiceras med HEPs och multipotenta HSPCs. Mössen övervakas sedan regelbundet för blod-och lever beredning genom immunophenotypning av blod och mätningar av Human-albuminnivåer i serum. Möss med en lyckad beredning av mer än 15% för både humana immunceller och HEPs är intraperitonealt injiceras med HIV-1. Effekten av HIV på levern kan bedömas så tidigt som 4-5 veckor efter infektion. Det är viktigt att notera att, eftersom HIV-1 används, alla nödvändiga försiktighetsåtgärder måste vidtas vid hantering av viruset och injicera det i möss.

Protocol

Detta protokoll har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) vid University of Nebraska Medical Center. Anmärkning: Inhämta godkännande från den lokala IACUC innan djurförsök utförs. 1. behandling av navelsträngsblod och isolering av mänskliga HSPCs Utför alla steg i protokollet under sterila förhållanden i laminärt flödes skåp. Ta navelsträngsblod (CB) samlas i hepariniserad …

Representative Results

Inrättandet av en dubbel humaniserad musmodell med mänskliga levern och immunceller kan lätt övervakas vid varje steg med mycket enkel ELISA och flödescytometri, respektive. Flödescytometri utförs regelbundet för att utvärdera utvecklingen av ett funktionellt immunsystem och för att se effekten av HIV-infektion på immunceller. I dubbla humaniserade möss, utveckling av funktionella immunceller kan variera från 15% till 90% av lymfocytgrinden. Representativa undergrupper av imm…

Discussion

Levern äventyras och skadas hos HIV-infekterade patienter24. Experimentella små djurmodeller för att studera mänskliga leversjukdomar i närvaro av HIV-1 är extremt begränsad, trots tillgängligheten av några cotransplanted djurmodeller med CD34+ hspcs och hepatocyter7,12, 25. I in vitro-experiment, hepatocyter visas ha låg nivå HIV-1-infektion26. Humaniserade …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av National Institute of Health Grant R24OD018546 (till L.Y.P. och S.G.). Författarna vill tacka Weizhe Li, Ph.D., för hjälpen i kirurgiska ingrepp, Amanda Branch Woods, BS, Yan Cheng för immunohistology, UNMC Flow flödescytometrianalys forskningsanläggning medlemmar regissören Phillip Hexley, Ph.D., Victoria B. Smith, BS, och Samantha Wall, BS, UNMC avancerad mikroskopi Core facility medlemmar Janice A. Taylor, BS, och James R. Talaska, BS, för teknisk support. Författarna erkänner DRS. Mamoru Ito och Hiroshi Suemizu från CIEA för att tillhandahålla TK-NOG möss och Dr Joachim Baumgart för att ge treosulfläkt. Författarna tackar Dr Adrian Koesters, UNMC, för hennes redaktionella bidrag till manuskriptet.

Materials

27G1/2" needles BD biosciences 305109
30G1/2" needles BD biosciences 305106
5 mL polystyrene  round-bottom tube 12 x 75 mm style Corning 352054
BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle BD biosciences 309659
BD FACS array bioanalyzer  BD Biosciences For purity check of eluted CD34+ cells 
BD FACS array software BD Biosciences Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array
BD FACS lysing solution BD Biosciences 349202 To lyse red blood cells
BD LSR II BD Biosciences Instrument for acquisiton of flow cytometry samples
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube BD biosciences BD 367874 To collect Cord blood
Bovine Serum Albumin  Sigma-aldrich A9576
Buprenorphine Controlled substance and pain-killer
CD14-PE BD Biosciences 555398 Specific to human
CD19-BV605 BD Biosciences 562653 Specific to human
CD34 MicroBead Kit, human Miltenyi Biotec 130-046-702 For isoation of   CD34+ HSPC
CD34-PE, human Miltenyi Biotec 130-081-002 Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells 
CD3-AF700 BD Biosciences 557943 Specific to human
CD45-PerCPCy5.5 BD Biosciences 564105 Specific to human
CD4-APC BD Biosciences 555349 Specific to human
CD8-BV421 BD Biosciences 562428 Specific to human
Cell counting slides Bio-rad 1450015
ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit Thermofisher scientific CS11204 for extraction of genomic DNA from ear piece
Cobas Amplicor system v1.5  Roche Molecular Diagnostics bioanalyzer to measure viral load
Cotton-tipped applicators   McKesson 24-106-2S
Cytokeratin-18 (CK18) DAKO M7010 Specific to human
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma-aldrich D2650-5X5ML
Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile BD biosciences 30914 Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion
FACS Diva version 6 BD Biosciences flow cytometer software required for  acqusition of sample
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10438026
FLOWJO analysis software
v10.2
FLOWJO, LLC flow cytometry analysis software
Ganciclovir APP Pharmaceuticals, Inc. 315110 Prescripition drug
Greiner MiniCollect EDTA Tubes Greiner bio-one 450475
Hepatocytes thawing medium  Triangle Research Labs  MCHT50
Horizon Open Ligating Clip Appliers Teleflex 537061 To hold the ligating clips
Hospira Sterile Water for Injection ACE surgical supply co. Inc. 001-1187 For dilution of Buprenorphine (pain-killer)
Human Albumin ELISA Quantitation Set Bethyl laboratories E80-129 For assesing human albumin levels in mouse serum
Human hepatocyte Triangle Research Labs  HUCP1  Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified 
Iris Scissors, Straight Ted Pella, Inc. 13295
Lancet MEDIpoint Goldenrod 5 mm
LS columns  Miltenyi Biotec 130-042-401 Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection)
Lymphocyte Separation Medium (LSM) MP Biomedicals 50494 For isoation of   lymphocytes from peripheral blood
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 holds Qudro MACS seperator and LS columns
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Instrument Co. RS-5605 Used to make an incision on skin to expose spleen
Micro Dissecting Forceps Roboz Surgical Instrument Co. RS-5157  to hold and pull out spleen from peritoneal cavity
mouse CD45-FITC BD Biosciences 553080 mouse-specific
PBS (Phosphate Buffered Saline) Hyclone SH30256.02
Qudro MACS separator  Miltenyi Biotec 130-090-976 holds four LS columns
RPMI 1640 medium Gibco 11875093
StepOne Plus Real Time PCR  Applied Biosystems Instrument used  to  genotype
Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml DYMAX CORP T15469 Used to  dispense  HSPC and HEP supension in controlled manner
Suturevet PGA synthetic absorbale suture Henry Schein Animal Health 41178 Suturing of skin and peritoneum
TaqMan Gene Expression Master Mix Thermofisher scientific 4369016
TC20 automated cell counter Bio-rad 1450102
TK-NOG mice  Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu)
Treosulfan Medac GmbH Provided by  Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) 
Trypan Blue Bio-rad 1450022
Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L Ted Pella, Inc. 1346 Used to make an incision on skin to expose spleen
Weck hemoclip traditional titanium ligating clips Esutures 523700 To ligate the spleen post-injection

References

  1. Smith, C., et al. Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study. AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).
  2. Puoti, M., et al. Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).
  3. Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection. The American Journal of Gastroenterology. 95 (5), 1316-1322 (2000).
  4. Scharschmidt, B. F., et al. Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival. Annals of Internal Medicine. 117 (10), 837-838 (1992).
  5. Lacombe, K., Rockstroh, J. HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges. Gut. 61, 47-58 (2012).
  6. Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
  7. Billerbeck, E., et al. Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells. The Journal of Hepatology. 65 (2), 334-343 (2016).
  8. Dagur, R. S., et al. Human hepatocyte depletion in the presence of HIV-1 infection in dual reconstituted humanized mice. Biology Open. 7 (2), (2018).
  9. Gaska, J. M., Ploss, A. Study of viral pathogenesis in humanized mice. Current Opinion in Virology. 11, 14-20 (2015).
  10. Gorantla, S., Poluektova, L., Gendelman, H. E. Rodent models for HIV-associated neurocognitive disorders. Trends in Neurosciences. 35 (3), 197-208 (2012).
  11. Xu, D., et al. Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (2), 274-280 (2015).
  12. Washburn, M. L., et al. A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease. Gastroenterology. 140 (4), 1334-1344 (2011).
  13. Gutti, T. L., et al. Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice. The American Journal of Pathology. 184 (1), 101-109 (2014).
  14. Strick-Marchand, H., et al. A novel mouse model for stable engraftment of a human immune system and human hepatocytes. PLoS One. 10 (3), 0119820 (2015).
  15. Keng, C. T., et al. Characterisation of liver pathogenesis, human immune responses and drug testing in a humanised mouse model of HCV infection. Gut. 65 (10), 1744-1753 (2016).
  16. Li, F., Nio, K., Yasui, F., Murphy, C. M., Su, L. Studying HBV Infection and Therapy in Immune-Deficient NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null (NRG) Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Knockout Mice Transplanted with Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 267-276 (2017).
  17. Poluektova, L. Y., Garcia, J. V., Koyanagi, Y., Manz, M. G., Tager, A. M. . Humanized Mice for HIV Research. , (2014).
  18. Cheng, L., Ma, J., Li, G., Su, L. Humanized Mice Engrafted With Human HSC Only or HSC and Thymus Support Comparable HIV-1 Replication, Immunopathology, and Responses to ART and Immune Therapy. Frontiers in Immunology. 9, 817 (2018).
  19. Zhang, L., Su, L. HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 237-244 (2012).
  20. Nunoya, J., Washburn, M. L., Kovalev, G. I., Su, L. Regulatory T cells prevent liver fibrosis during HIV type 1 infection in a humanized mouse model. The Journal of Infectious Diseases. 209 (7), 1039-1044 (2014).
  21. Hasegawa, M., et al. The reconstituted ‘humanized liver’ in TK-NOG mice is mature and functional. Biochemical and Biophysical Research Communications. 405 (3), 405-410 (2011).
  22. Higuchi, Y., et al. The human hepatic cell line HepaRG as a possible cell source for the generation of humanized liver TK-NOG mice. Xenobiotica. 44 (2), 146-153 (2014).
  23. Kosaka, K., et al. A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (1), 230-235 (2013).
  24. Crane, M., Iser, D., Lewin, S. R. Human immunodeficiency virus infection and the liver. World Journal of Hepatology. 4 (3), 91-98 (2012).
  25. Bility, M. T., Li, F., Cheng, L., Su, L. Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver tropic virus infection in humanized mouse models. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28, 120-124 (2013).
  26. Kong, L., et al. Low-level HIV infection of hepatocytes. Virology Journal. 9, 1-7 (2012).
  27. Dash, P. K., et al. Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice. AIDS. 26 (17), 2135-2144 (2012).
  28. Sun, S., Li, J. Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection. International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).
  29. Shafritz, D. A., Oertel, M. Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).
  30. Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep. Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).
  31. Streetz, K. L., et al. Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells. Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).
check_url/58645?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Dagur, R. S., Wang, W., Makarov, E., Sun, Y., Poluektova, L. Y. Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis. J. Vis. Exp. (151), e58645, doi:10.3791/58645 (2019).

View Video