Coeruleus לוקוס יש מקבץ קטן של נוירונים מעורב במגוון רחב של תהליכים פיזיולוגיים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי להתכונן חלקים במוח העכבר מחקרים של חלבונים, מתכות בגרעין הזה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
הודעת תיקון
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
סיכום
תקציר
Coeruleus לוקוס (LC) היא מרכז חשוב של נוראדרנלין לייצר נוירונים זה לווסת את מספר פונקציות פיזיולוגיים. מומים מבניים או פונקציונלי של LC להשפיע מספר אזורים במוח כולל קליפת המוח, ההיפוקמפוס של המוח הקטן, עשוי לתרום דיכאון, הפרעה דו קוטבית, חרדה, כמו גם מחלת פרקינסון, אלצהיימר. הפרעות אלה הקשורים לעתים קרובות עם misbalance מתכת, אך התפקיד של מתכות LC מובנת באופן חלקי בלבד. מחקרים מורפולוגיות ופונקציונליים של LC נחוצים כדי להבין טוב יותר את פתולוגיות האנושית ואת התרומה של מתכות. עכברים הם מודל ניסיוני בשימוש נרחב, אבל העכבר LC הוא קטן (~0.3 מ"מ קוטר), קשה לזהות שאינו מומחה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מבוסס אימונוהיסטוכימיה צעד אחר צעד כדי להתאים לשפה של LC במוח העכבר. דופמין-β-hydroxylase. דבח, (. מלך אקסום), לחלופין, טירוזין hydroxylase (ה), שני אנזימים מאוד שבאה לידי ביטוי LC, משמשים כסמני immunohistochemical פרוסות המוח. מקטעים סמוכים למקטעים המכילים LC יכול לשמש לצורך ניתוח נוסף, כולל היסטולוגיה מחקרים מורפולוגי, בדיקות מטבוליות, כמו גם הדמיה מתכת על ידי רנטגן פלורסצנטיות מיקרוסקופ (XFM).
מבוא
Coeruleus לוקוס (LC) הוא אזור חשוב לגזע המוח, האתר העיקרי של נוראפינפרין (NE) ייצור1. LC שולחת תחזיות ברחבי המוח2 קליפת המוח, ההיפוקמפוס של המוח הקטן3 , ולאחר מווסת תהליכים פיזיולוגיים העיקריים, כולל שעון ביולוגי4,5, תשומת לב, זיכרון6, להדגיש7, תהליכים קוגניטיביים8ו9,רגש10. תפקוד לקוי של LC היה מעורב והפרעות נוירולוגיות מנוטלי11, כולל פרקינסון מחלת12,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקרים של חיות אושרה על ידי ג'ונס הופקינס אוניברסיטת טיפול בעלי חיים, מספר פרוטוקול שימוש (ACUC) M017M385.
1. המוח חותך
- לשתק, עזים ומתנגד עכברים על-ידי היישום של 3% איזופלוריין.
- לספוג כדור צמר גפן עם טיפות של איזופלוריין והנח אותו בצינור microcentrifuge 15 mL. המקום האף של החיה לתוך הצינור ולאפשר לשאוף את איזופלוריין. בדוק עומק ההרדמה לתחושה של חוסר תגובה הבוהן-קורט.
- במקום החיה על גבו, לשתק אותו על-ידי הצמדת הגפיים שלו עם סיכה T תוך גישה בבטן.
- לחתוך את החיה עם מספריים כירורגיים על ידי ביצוע חיתוך בעור בטן ו לחתוך העור באזור החזה. להצמיד את העור באמצעות סיכות T. ואז לשבור את קרום הצפק אל בית....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שינויים הומאוסטזיס מתכת (כגון Cu, Fe, Zn, Mn) הם נצפו לעתים קרובות בהפרעות רגשיות ונוירולוגיות, לרבות שינויים LC34,35. לפיכך, קביעת רמות מתכת במוח הכרחי להבנה של מנגנוני המחלה. הסעיפים המוח שנוצרו באמצעות פרוטוקול המתואר ניתן לכמת את הרמות של Cu ומתכות אחרות LC ולהשוות אותם על הרמות באזורים מחוץ LC. (איור 3). בדוגמה שלנו, הפרוסה המוח זה נחתך באמצעות LC, פוספט, אשלגן, כלוריד, נחושת נמדדה. נחושת היחיד ה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כראוי המכוונת את הדגימה היא שלב קריטי פרוטוקול זה. מאחר ואנו משתמשים תכונות אנטומיות של המשטח הגבי של המוח כדי לאתר LC (הגבול בין המוח הקטן רקתי נחות), חשוב כי הסעיפים ליישר כהלכה. הדבר דורש טיפול בקביעת כראוי המוח לתוך מאטריקס מבצעה מוח העכבר. אנו ממליצים לחתוך ~ 500 μm יותר רקמות anterior ואת אחורי כדי LC כדי למנוע חסר הגרעין. הטעות הנפוצה ביותר היא לחתוך קטעים מעטים מדי כי התוצאות מפספס לחלוטין את LC. לפיכך, לראשונה אחד בעקבות פרוטוקול זה, אנו ממליצים לחתוך קטעים יותר מהדרוש. לימוד מעמיק של המוח אטלס תמונות לפני צביעת.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
אנו מודים Abigael Muchenditsi על קיומו של המושבה העכבר. השימוש המקור הפוטון מתקדם ב Argonne National Laboratory נתמכה על ידי משרד האנרגיה האמריקני, משרד המדע, משרד של בסיסי אנרגיה למדעים, תחת מספר חוזה: דה-AC02-06CH11357. אנו מודים אולגה Antipova, ד ר סטפן ווגט על המשתמש תמיכה וסיוע למקור הפוטון מתקדם. עבודה זו מומן על ידי 2R01GM101502 גרנט המכון הלאומי לבריאות ל SL.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מטריצת פורס מוח של עכבר בוגר | Zivic Instruments | BSMAS001-1 | |
| נוגדן משני נגד ארנב, Alexa Fluor 488 (מקור - חמור) | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| שקופיות זכוכית טעונות | Genesee | 29-107 | |
| מיקרוסקופ קונפוקלי | Zeiss | LSM 800 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 505E | |
| להבי חיתוך קריוסטט | Thermo Fisher Scientific | MX35 | |
| מספריים מיני, 9.5 ס"מ | Antech Diagnostcs | 503241 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| נוגדן דופמין ובטא;-הידרוקסילאז (DBH) - ייצור פנימי (מקור - ארנב) | B. אייפר | - | |
| נוגדן דופמין ובטא;-הידרוקסילאז (DBH) - זמין מסחרית (מקור - ארנב) | איתות תאים | 8586 | |
| שפופרות פלקון, 50 מ"ל | ארה"ב | 339652 | |
| מדעי פוראן (איזופלואורן) | בקסטר | NDC 1019-360-60 | |
| מלקחיים מיקרו אדסון | Antech Diagnostcs | 501245 | |
| מדיה הרכבה קשיחה | EM sciences | 17984-24 | |
| מיקרוסקופ | פסקל | LSM 5 | |
| צלחות מרובות בארות, 24 בארות | תרמו פישר סיינטיפיק | 930186 | |
| תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) | VWR / טכנולוגיית רקמות | 102094-106 | |
| פרפורמלדהיד (PFA) / פורמלין 10% | פישר סיינטיפיק | SF98-4 | |
| תבניות הטבעה חד פעמיות Peel-A-Way | Polysciences Inc. | 18646A | |
| מברשת | |||
| פוספט חוצץ מלח (PBS) | Life Tech | 14190250 | |
| סכיני גילוח | אמזון | ASIN: B000CMFJZ2 | |
| מרית | Antech Diagnostcs | 14374 | |
| T פינים | אופיס דיפו | 344615 | |
| מוח העכבר בקואורדינטות סטריאוטקסיות, Paxinos ופרנקלין, מהדורה שלישית | של אמזון | ISBN: 978-0123694607 | |
| Triton-X 100 (להכנת PBSD) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| נוגדן טירוזין הידרוקסילאז (TH) (מקור - ארנב) | EMD Millipore | AB152 | |
| Ultralene סרט דק עבור XRF | SPEX Sample Prep | 3525 | |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעל שדה רחב | Zeiss | Axio Zoom.V16 |
מקורות
- Robertson, S. D., Plummer, N. W., de Marchena, J., Jensen, P. Developmental origins of central norepinephrine neuron diversity. Nature neuroscience. 16, 1016-1023 (2013).
- Kobayashi, R. M., Palkovits, M., Jacobowitz, D. M., Kopin, I. J.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תיקון
Formal Correction: Erratum: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 4/08/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain. An author affiliation was updated.
The affiliation for Evan Maxey was updated from:
Department of Neuroscience, Johns Hopkins University
to:
X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory
