Nanoparticules de Polyéthylèneimine recouvertes d’oxyde de fer comme un véhicule pour la livraison de petits ARN interférents à Macrophages In Vitro et In Vivo
Summary
Les auteurs décrivent une méthode d’utilisation polyéthylèneimine (PEI)-enduit superparamagnetic iron oxide nanoparticules pour la transfection des macrophages avec siARN. Ces nanoparticules peuvent délivrer efficacement des siARN d’expression du gène cible in vitro et in vivo et silence macrophages.
Abstract
En raison de leur rôle crucial dans la régulation des réponses immunitaires, les macrophages ont constamment fait l’objet de recherches intensives et représentent une cible thérapeutique prometteuse dans plusieurs maladies, telles que les maladies auto-immunes, l’athérosclérose et le cancer. Silençage génique véhiculée par Arni est une approche utile de choix de sonde et de manipuler la fonction des macrophages ; Toutefois, la transfection des macrophages avec siARN est souvent considéré comme pour être techniquement difficile et, à l’heure actuelle, il existe quelques méthodes dédiés au transfert de siARN aux macrophages. Nous présentons ici un protocole d’utilisation de nanoparticules d’oxyde de fer superparamagnétique polyéthylèneimine-enduit (PEI-SPIONs) comme un véhicule pour l’administration ciblée d’ARNsi aux macrophages. PEI-SPIONs sont capables de liaison et de condensation complètement siARN lorsque le rapport de poids / Fe : siARN atteint 4 et au-dessus. In vitro, ces nanoparticules peuvent délivrer efficacement siRNA dans les macrophages primaires, ainsi que dans la lignée cellulaire de type macrophages RAW 264.7, sans compromettre la viabilité des cellules à la dose optimale pour la transfection, et, en fin de compte, ils induisent induite par le siARN cible silençage génique. Outre utilisé pour in vitro transfection de siARN, PEI-SPIONs sont un outil prometteur pour la livraison des siARN à macrophages in vivo. Compte tenu de ses caractéristiques combinées de propriété magnétique et capacité de gène-baffle, systématiquement administré PEI-SPION/siARN particules devraient non seulement pour moduler la fonction de macrophage, mais aussi pour activer les macrophages à être photographié et suivies. En substance, PEI-SPIONs représentent une plate-forme nonviral simple, sûre et efficace pour la livraison de siARN aux macrophages in vitro et in vivo.
Introduction
Les macrophages sont un type de cellules immunitaires innées, distribué dans tous les tissus de l’organisme, mais dans des quantités différentes. En produisant une variété de cytokines et d’autres médiateurs, ils jouent un rôle crucial dans la défense de l’hôte contre l’invasion des pathogènes microbiens, à la réparation des tissus après une blessure et dans le maintien de l’homéostasie tissulaire1. En raison de leur importance, les macrophages ont continuellement fait l’objet de recherches intensives. Cependant, malgré sa prévalence dans la régulation des gènes et des études de fonction, siARN-mediated gene silencing est moins susceptible de réussir dans les macrophages, parce que ces cellules — en particulier, les macrophages primaires — sont souvent difficiles à transfecter. Ceci peut être attribué à un degré relativement élevé de toxicité associé à des approches plus bien établies de transfection dans lequel la membrane cellulaire est chimiquement (par exemple, avec des polymères et des lipides) ou physique (p. ex., par électroporation et canons de gène) perturbé pour laisser les siARN molécules traversent la membrane, réduisant ainsi considérablement viabilité2,3 des macrophages. En outre, les macrophages sont des phagocytes dédiés riches en enzymes de dégradation. Ces enzymes peuvent endommager l’intégrité des siARN, affaiblissement de l’efficacité de son silencieux même si gène-spécifique siARN a été remis dans la cellule3,4. Par conséquent, un système d’administration des siARN efficaces axés sur les macrophages a besoin pour protéger l’intégrité et la stabilité des siARN au cours de la livraison4.
Il est de plus en plus évident que les macrophages dysfonctionnels sont impliqués dans l’apparition et la progression de certains troubles cliniques courants comme les maladies auto-immunes, l’athérosclérose et le cancer. Pour cette raison, en modulant la fonction des macrophages avec, par exemple, siRNA, a été en train de devenir une méthodologie attrayante pour le traitement de ces troubles5,6,7. Si beaucoup de progrès ont été accompli, un enjeu majeur de la stratégie de traitement fondées sur des siARN est la spécificité cellulaire pauvre de siARN systématiquement administré et l’absorption de siARN insuffisante par les macrophages, qui par conséquent conduire à des effets secondaires indésirables. Par rapport aux thérapies de libre d’acide nucléique qui manquent généralement de sélectivité cellulaire optimale et conduisent souvent à des effets indésirables, chargé de drogue nanoparticles (NPs), en raison de leur propension spontanée d’être capturé par le système réticulo-endothélial, hors cible peut être conçue pour le ciblage passive à macrophages en vivo, permettant une meilleure efficacité thérapeutique avec des effets secondaires minimes8. Courants NPs explorés pour l’administration de molécules d’ARN incluent nanocarriers inorganiques et liposomes divers polymères9. Parmi eux, polyéthylèneimine (PEI), un type de polymères cationiques lier et condensation des acides nucléiques dans NPs stabilisées, montre l’ARN plus haut livraison capacité9,10. PEI protège des acides nucléiques de la dégradation enzymatique et non-enzymatique, médiatise leur transfert à travers la membrane cellulaire et favorise leur libération intracellulaire. Bien qu’initialement présenté comme un réactif de livraison de l’ADN, PEI a été démontré par la suite pour être une plate-forme attrayante pour in vivo ARNsi, soit localement ou de manière systématique9,10.
Nanoparticules superparamagnétiques d’oxyde de fer (SPIONs) ont montré de grandes promesses en biomédecine, en raison de leurs propriétés magnétiques, de biocompatibilité, de taille comparable aux objets biologiquement importants, surface-surface-à-volume élevé et facilement adaptable surface pour ètre pièce jointe11. Par exemple, en raison de leur utilité potentielle comme agent de contraste et une absorption rapide par les macrophages, SPIONs ont émergé comme un outil clinique préféré à l’image de macrophages tissulaires12. Alors que SPIONs ont également été largement étudiées sous la forme d’acide nucléique livraison véhicules11,13,14,15, à notre connaissance, la littérature contienne peu de rapports de SPIONs comme un support pour ARNsi axés sur les macrophages. Pour la livraison de gène de SPIONs, leur surface est généralement recouvert d’une couche de polymères cationiques hydrophiles sur lequel des acides nucléiques chargés négativement peut être électrostatiquement attirés et attachés. Nous présentons ici une méthode de synthèse de SPIONs dont la surface est modifiée avec faible poids moléculaire (10 kDa), PEI ramifié (PEI-SPIONs). Ces nanoplatforms magnétiques travaillent alors à se condenser siRNA, formant des complexes de PEI-SPION/siARN qui permettent le transport de siARN dans la cellule. Nous avons raison cette phagocytose spontanée de SPIONs par les cellules du système réticulo-endothélial16, associée à la forte capacité de liaison et condensation des acides nucléiques par PEI, rend PEI-SPIONs adapté pour le transport efficace des siARN dans macrophages. Les données présentées ici confirment la faisabilité de PEI-SPION/siARN-mediated gene silencing dans les macrophages en culture ainsi qu’in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les macrophages sont réfractaires à transfecter par des approches nonviral couramment utilisées, telles que l’électroporation, liposomes cationiques et espèces de lipides. Ici, nous avons décrit une méthode fiable et efficace pour transfecter macrophages avec siARN. En utilisant le présent protocole, plus 90 % des macrophages RAW 264.7 cellules (Figure 2 b) et le rat macrophages péritonéaux18 peut être transfectées avec les siARN sans dégradation notabl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81772308) et le National clé de recherche et programme de développement de Chine (n° 2017YFA0205502).
Materials
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal bovine serum | Gibco | A31608-02 | |
| Penicillin/streptomycin (1.5 ml) | Gibco | 15140122 | |
| Tetrazolium-based MTS assay kit | Promega | G3582 | For cytotoxicity analysis |
| RAW 264.7 cell line | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China | TCM13 | |
| Tissue culture plates (6-well) | Corning | 3516 | |
| Tissue culture dishes (10 cm) | Corning | 430167 | |
| RNase-free tubes (1.5 ml) | AXYGEN | MCT-150-C | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430791 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| Wistar rats | Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences |
||
| Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder | National Institutes for Food and Drug Control, China |
for inducing adjuvant arthritis in rats | |
| siRNA | GenePharma (Shanghai, China) | ||
| Cy3-siRNA | RiboBio (Guangzhou, China) | ||
| Polyethyleneimine (10 kDa) | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | E107079 | |
| Ammonia water | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | A112077 | |
| Oleic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | O108484 | |
| Dimethylsulfoxide | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D103272 | |
| FeSO4•7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012118 | |
| FeCl3•6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011918 | |
| Dimercaptosuccinic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D107254 | |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC910096 | |
| Tetramethylammonium hydroxide solution | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | T100882 | |
| Particle size and zeta potential analyzer | Malvern, England | Nano ZS90 |
References
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