हम मैक्रोफेज के साथ transfecting सिरना के लिए polyethyleneimine (पी)-लेपित superparamagnetic आयरन ऑक्साइड नैनोकणों का उपयोग करने की एक विधि का वर्णन । इन नैनोकणों को कुशलतापूर्वक सिरना में मैक्रोफेज करने के लिए और vivo और मौन लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति में उद्धार कर सकते हैं ।
प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका की वजह से, मैक्रोफेज लगातार गहन अनुसंधान का विषय रहा है और ऐसे स्व-प्रतिरक्षित रोग, atherosclerosis, और कैंसर के रूप में कई विकारों में एक होनहार चिकित्सकीय लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं । RNAi-मध्यस्थता जीन मुंह बंद करने चुनाव की जांच करने के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण है और मैक्रोफेज समारोह में हेरफेर; हालांकि, सिरना के साथ मैक्रोफेज के अभिकर्मक अक्सर तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण माना जाता है, और, वर्तमान में, कुछ के तरीके मैक्रोफेज को सिरना हस्तांतरण के लिए समर्पित उपलब्ध हैं । यहां, हम सिरना के लिए मैक्रोफेज के लक्षित वितरण के लिए एक वाहन के रूप में polyethyleneimine लेपित superparamagnetic आयरन ऑक्साइड नैनोकणों (पी-SPIONs) का उपयोग करने का एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । पी-SPIONs बाध्यकारी और पूरी तरह से संघनित्र सिरना जब Fe: सिरना वजन अनुपात 4 और ऊपर तक पहुंच में सक्षम हैं । इन विट्रो में, इन नैनोकणों कुशलतापूर्वक प्राथमिक मैक्रोफेज में सिरना उद्धार कर सकते हैं, के रूप में अच्छी तरह के रूप में मैक्रोफेज-कच्चे २६४.७ सेल लाइन की तरह, अभिकर्मक के लिए इष्टतम खुराक पर सेल व्यवहार्यता समझौता किए बिना, और, अंततः, वे प्रेरित सिरना-मध्यस्थता लक्ष्य जीन मुंह बंद करने. इसके अलावा इन विट्रो में के लिए इस्तेमाल किया जा रहा सिरना अभिकर्मक, पी-SPIONs भी vivo मेंमैक्रोफेज करने के लिए सिरना पहुंचाने के लिए एक आशाजनक उपकरण हैं । चुंबकीय संपदा और जीन-मुंह बंद करने क्षमता की अपनी संयुक्त सुविधाओं को ध्यान में रखते हुए, प्रणालीबद्ध प्रशासित पी-SPION/सिरना कणों की अपेक्षा की जाती है न केवल मैक्रोफेज समारोह का नियमन करने के लिए बल्कि मैक्रोफेज को भी सक्षम करने के लिए imaged और ट्रैक किया जा सकता है । संक्षेप में, पी-SPIONs सिरना वितरण के लिए एक सरल, सुरक्षित, और प्रभावी गैर वायरल मंच का प्रतिनिधित्व दोनों विट्रो में और vivo मेंमैक्रोफेज ।
मैक्रोफेज शरीर के सभी ऊतकों में वितरित जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं का एक प्रकार है, हालांकि अलग मात्रा में । साइटोकिंस और अन्य मध्यस्थों की एक किस्म का उत्पादन करके, वे चोट के बाद ऊतक मरम्मत में माइक्रोबियल रोगजनकों पर हमला करने के खिलाफ मेजबान रक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और ऊतक homeostasis1बनाए रखने में । इनके महत्व के कारण मैक्रोफेज लगातार गहन शोध का विषय रहा है. हालांकि, जीन विनियमन और समारोह के अध्ययन में अपनी व्यापकता के बावजूद, सिरना-मध्यस्थता जीन मुंह बंद करने कम मैक्रोफेज में सफल होने की संभावना है क्योंकि इन कोशिकाओं को विशेष रूप से, प्राथमिक मैक्रोफेज-अक्सर transfect मुश्किल है । यह सबसे अच्छी तरह से स्थापित अभिकर्मक दृष्टिकोण जिसमें कोशिका झिल्ली रासायनिक है के साथ जुड़े विषाक्तता के एक अपेक्षाकृत उच्च डिग्री करने के लिए जिंमेदार माना जा सकता है (जैसे, पॉलिमर और लिपिड के साथ) या शारीरिक रूप से (जैसे, electroporation द्वारा और जीन बंदूकें) दो सिरना अणुओं झिल्ली को पार करने के लिए बाधित है, जिससे काफी ‘ मैक्रोफेज व्यवहार्यता को कम करने2,3। इसके अलावा, मैक्रोफेज degradative एंजाइमों में अमीर फ़ैगोसाइट समर्पित कर रहे हैं । इन एंजाइमों सिरना की अखंडता को नुकसान पहुंचा सकते हैं, भले ही जीन विशिष्ट सिरना सेल3,4में दिया गया है अपनी मुंह बंद करने दक्षता कमजोर । इसलिए, एक प्रभावी मैक्रोफेज-लक्षित सिरना वितरण प्रणाली अखंडता और सिरना की स्थिरता की रक्षा के लिए4प्रसव के दौरान की जरूरत है ।
यह तेजी से स्पष्ट है कि बेकार मैक्रोफेज दीक्षा और स्व-प्रतिरक्षित रोग, atherosclerosis, और कैंसर जैसे कुछ आम नैदानिक विकारों की प्रगति में फंसा रहे हैं । इस कारण के लिए, के साथ मैक्रोफेज समारोह मॉडुलन, उदाहरण के लिए, सिरना, इन विकारों के इलाज के लिए एक आकर्षक पद्धति के रूप में उभर रहा है5,6,7. हालांकि बहुत प्रगति की गई है, सिरना के एक प्रमुख चुनौती आधारित उपचार रणनीति प्रणालीबद्ध प्रशासित सिरना के गरीब कोशिका विशिष्टता और मैक्रोफेज द्वारा अपर्याप्त सिरना है, जो फलस्वरूप अवांछित दुष्प्रभावों के लिए नेतृत्व । नि: शुल्क न्यूक्लिक एसिड चिकित्सकीय है कि आमतौर पर इष्टतम सेल selectivity कमी और अक्सर बंद लक्ष्य को प्रतिकूल प्रभाव, दवा भरी नैनोकणों (एनपीए) का नेतृत्व के साथ तुलना में, उनके सहज प्रवृत्ति के कारण reticuloendothelial प्रणाली द्वारा कब्जा किया जा रहा है, निष्क्रिय लक्ष्यीकरण के लिए vivo मेंमैक्रोफेज करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है, न्यूनतम साइड इफेक्ट8के साथ बेहतर चिकित्सकीय प्रभावकारिता के लिए अनुमति देता है. मौजूदा एनपीएस आरएनए अणुओं के वितरण के लिए अन्वेषण अकार्बनिक nanocarriers, विभिन्न liposomes, और पॉलिमर9शामिल हैं । उनमें से, polyethyleneimine (पी), स्थिर एनपीएस में न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी और संघनित्र में सक्षम cationic पॉलिमर का एक प्रकार, उच्चतम आरएनए देने क्षमता9,10से पता चलता है । पी एंजाइमी और nonenzymatic गिरावट से न्यूक्लिक एसिड की रक्षा करता है, कोशिका झिल्ली के पार उनके स्थानांतरण मध्यस्थता, और उनके intracellular रिलीज को बढ़ावा देता है । हालांकि शुरू में एक डीएनए प्रसव के एजेंट के रूप में पेश किया, पी बाद में vivo सिरना वितरण, या तो स्थानीय या प्रणालीबद्ध9,10में के लिए एक आकर्षक मंच हो प्रदर्शन किया था ।
Superparamagnetic आयरन ऑक्साइड नैनोकणों (SPIONs) जैव चिकित्सा में महान वादा दिखाया है, उनके चुंबकीय गुणों के कारण, जैविक रूप से महत्वपूर्ण वस्तुओं के लिए तुलनीय आकार, उच्च सतह क्षेत्र-मात्रा अनुपात, और आसानी से अनुकूलनीय सतह के लिए-एजेंट अनुलग्नक11। उदाहरण के लिए, एक विपरीत एजेंट और मैक्रोफेज द्वारा तेजी से तेज के रूप में अपने संभावित उपयोगिता की वजह से, SPIONs12मैक्रोफेज छवि ऊतक के लिए एक पसंदीदा नैदानिक उपकरण के रूप में उभरा है । जबकि SPIONs भी बड़े पैमाने पर न्यूक्लिक एसिड डिलीवरीवाहनों11,13,14,15के रूप में अध्ययन किया गया है, हमारे ज्ञान के लिए, साहित्य के लिए एक वाहक के रूप में SPIONs के कुछ रिपोर्टों में शामिल मैक्रोफेज-लक्षित सिरना वितरण । SPIONs द्वारा जीन वितरण के लिए, उनकी सतह आमतौर पर हाइड्रोफिलिक cationic पॉलिमर की एक परत है जिस पर नकारात्मक न्यूक्लिक एसिड का आरोप लगाया electrostatically आकर्षित किया जा सकता है और सीमित के साथ लेपित है । यहां, हम synthesizing SPIONs के लिए एक तरीका है जिसकी सतह कम आणविक वजन (10 केडीए), बंटी पी (पी-SPIONs) के साथ संशोधित किया गया है प्रस्तुत करते हैं । इन चुंबकीय nanoplatforms तो गाढ़ा सिरना करने के लिए कार्यरत हैं, बनाने बेई-SPION/सिरना परिसरों कि सेल में सिरना परिवहन सक्षम करें । हम reticuloendothelial प्रणाली16की कोशिकाओं द्वारा SPIONs की है कि सहज phagocytosis कारण, बेई द्वारा बाध्यकारी और संघनित्र न्यूक्लिक एसिड की मजबूत क्षमता के साथ युग्मित, SPIONs के कुशल परिवहन के लिए पी-सिरना उपयुक्त renders Macrophages. यहां प्रस्तुत आंकड़ों में मैक्रोफेज में पी-SPION/सिरना-मध्यस्थता जीन मुंह बंद करने की व्यवहार्यता के साथ-साथ vivoमें संस्कृति का समर्थन है ।
मैक्रोफेज electroporation, cationic liposomes, और लिपिड प्रजातियों के रूप में आमतौर पर इस्तेमाल किया वायरल दृष्टिकोण, द्वारा transfect करने के लिए दुर्दम्य हैं । यहां हम सिरना के साथ मैक्रोफेज transfect करने के लिए एक विश्वसनीय और कुशल …
The authors have nothing to disclose.
इस काम को राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन ऑफ चाइना (८१७७२३०८) और चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (No. 2017YFA0205502) ने समर्थन दिया था ।
DMEM | Gibco | C11995500BT | Warm in 37°C water bath before use |
Fetal bovine serum | Gibco | A31608-02 | |
Penicillin/streptomycin (1.5 ml) | Gibco | 15140122 | |
Tetrazolium-based MTS assay kit | Promega | G3582 | For cytotoxicity analysis |
RAW 264.7 cell line | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China | TCM13 | |
Tissue culture plates (6-well) | Corning | 3516 | |
Tissue culture dishes (10 cm) | Corning | 430167 | |
RNase-free tubes (1.5 ml) | AXYGEN | MCT-150-C | |
Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430791 | |
Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
Wistar rats | Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences |
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Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder | National Institutes for Food and Drug Control, China |
for inducing adjuvant arthritis in rats | |
siRNA | GenePharma (Shanghai, China) | ||
Cy3-siRNA | RiboBio (Guangzhou, China) | ||
Polyethyleneimine (10 kDa) | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | E107079 | |
Ammonia water | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | A112077 | |
Oleic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | O108484 | |
Dimethylsulfoxide | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D103272 | |
FeSO4•7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012118 | |
FeCl3•6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011918 | |
Dimercaptosuccinic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D107254 | |
ultrafiltration tube | Millipore | UFC910096 | |
Tetramethylammonium hydroxide solution | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | T100882 | |
Particle size and zeta potential analyzer | Malvern, England | Nano ZS90 |