全取り付ける染色を用いた 3 D 白色脂肪組織構造の可視化
Summary
現在の研究の焦点は、脂肪組織のアーキテクチャと細胞成分の 3 D イメージングのための理想的な方法として全取り付ける染色と可視化手法を示すことです。
Abstract
脂肪組織は高い可塑性に重要な新陳代謝器官を環境刺激と栄養状態に応答するものです。そのため、脂肪組織の形態学を研究する様々 な技術を開発されています。しかし、従来の可視化方法は、全臓器の 3 D アーキテクチャを取り込みに失敗して 2D 断面の組織を勉強に限定されます。ホール マウントの紹介染色、最小限の処理手順とそのまま脂肪組織形態を維持する免疫組織化学法。したがって、組織の最も代表的な 3 D の可視化を実現する、歪みのない脂肪細胞と他の細胞成分の構造が保持されます。さらに、全取り付ける染色は細胞運命の意思決定を行う系統トレース メソッドと組み合わせることができます。ただし、この手法には、脂肪組織のより深い部分に関する正確な情報を提供することにいくつかの制限があります。この制限を克服するために全取り付ける染色することができますさらと組み合わせる組織を組織の不透明を外しライト シート蛍光顕微鏡を用いた全体脂肪組織解剖学の完全な可視化を可能にする技術をクリアします。したがって、高解像度、脂肪組織構造のより正確な表現は、これらの技術の組み合わせでキャプチャできます。
Introduction
脂肪組織は、エネルギー貯蔵のための不可欠な臓器で動的リモデリングとほぼ無制限の拡張1によって特徴付けられます。エネルギー恒常性脂肪組織もその以上 50 アディポカイン2全身の代謝機能を調節するためのホルモン分泌に重要な役割を果たしています。脂肪組織は成熟脂肪細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、免疫細胞、脂肪細胞の前駆細胞の3を含む様々 な細胞タイプの多様なアーキテクチャ構成します。最近の研究は、肥満やその他の代謝異常大幅変更できます脂肪組織の機能とその微小環境が含まれていますが、脂肪細胞、炎症細胞浸潤の拡大に制限されていませんを示した (などマクロファージ)、および血管機能障害3。
組織学などセクショニング従来の形態学的手法を示す組織収縮と構造歪み3につながることができます長い化学処理手順など脂肪の生物学の勉強にいくつかの制限 4。また、これらの 2 D 技術は得られたセクションは全体組織3の小さな地域に限られている異なったセルタイプによって出される細胞間の相互作用を観察するのに十分ではありません。蛍光イメージングの方法を従来のに比べて、全取り付ける染色手順は必要ありません追加侵襲、埋め込み、断面、脱水; などこのように、抗体の特異性の減少という問題を避けることができます。そのため、イメージング脂肪組織は、脂肪細胞の形態と全体的な脂肪組織構造5のより良い保全のためシンプルかつ効率的な方法です。したがって、全取り付ける染色迅速かつ安価な反応技術は脂肪組織 3 D アーキテクチャ1,6,7、8を維持するために確立されました。
ただし、全取り付ける染色の使用による脂肪組織形態の保存、にもかかわらずこの手法はまだ組織の脂質の表面の下に内部構造を可視化することができます。いくつかの最近の研究の9,10は、組織の脂肪組織内にある包括的な 3 D 可視化のためには全体マウント反応1,6と組み合わせる技術をクリアを確立しています。特に、神経・血管の密なネットワークは、最近研究9,10、11,12 3 D ボリューム イメージングと, 可視化されました。確かに、さまざまな生理学的な条件の下の脂肪組織の神経・血管の可塑性を勉強してその生物を勉強する不可欠です。溶媒消去器官 (iDISCO +) 組織の清算の反応が有効な三次元画像は、反応、メタノールの前処理から成る有機化学試薬ジクロロ メタン (DCM で組織の不透明のクリア プロセス) ジベンジル エーテル (DBE)13,14。完全透明に脂肪組織することによって血管や神経繊維など組織内の解剖学のより正確な表現の9,10が入手できます。IDISCO + 各種抗体、蛍光レポーター11,14と互換性がある、それは複数の臓器とも embryoes14の成功を示しているという点で利点があります。しかし、その主な制限は長い培養時間、18 〜 20 日が実験全体を完了する必要があります。
他の重要なアプリケーションを全取り付ける染色リネージュ トレース システムとの組み合わせで細胞の運命の視覚化であります。トレースする血統は、すべて娘細胞に渡されることができます、時間15以上保存されているセル内の特定の遺伝子/マーカーのラベルです。そのため、15セルの子孫の運命を決定するために使用することができます強力なツールです。さらに, 組換えシステム、1990 年代からリビングでトレースする血統の強力な手法となっています生物15。DNA シュプリンガー酵素 Cre を表すマウス行目は, 停止, シーケンスに隣接している記者を表現する別のマウス線と交差されたとき、レポーター蛋白質は表明した15です。
全取り付ける染色、蛍光多色記者の使用は16脂肪細胞の細胞内の活動に干渉を最小限にできるため、脂肪組織のイメージングに適しています。ただし、伝統的な記者は通常細胞質コンテンツ17が限られている白色脂肪細胞の系統を追跡は困難、細胞質を染色します。この問題を克服するために、膜結合型蛍光 tdTomato/膜 eGFP (mT/mG) 記者マーカーの使用は理想的なツールです。膜をターゲットとした tdTomato は、Cre 負セル18で表されます。Cre 切除時に膜ターゲット eGFP の発現への切り替えが発生する脂肪細胞の前駆細胞の17,18 (補足図 1) の系譜をたどり、この記者を適してします。
本稿の目的は、全取り付ける染色の詳細なプロトコルを提供し、開発や脂肪組織の生理学を勉強する他の技術との混合方法を表示することです。このプロトコルで記述されているアプリケーションの 2 つの例は、1) 多色レポーター マウスの脂肪細胞と白色脂肪組織 (WAT) で神経の分枝の詳細に視覚化するクリア 2) 組織の様々 な起源を識別する行とその使用です。
Protocol
Representative Results
Discussion
組織学や cryosection など従来の技術は、細胞内構造観察のための利点を提供して、全取り付ける染色細胞の 3次元可視化を可能にする脂肪組織研究の別の視点を提供します最低限の処理組織のアーキテクチャです。
全取り付ける染色を正常に実行するために次の提案を考慮します。拠点別の脂肪組織は様々 な免疫染色結果をもたらすことができます。したがって、脂肪組?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
自然科学と工学研究会 (レベル) カナダ ・ パイロット ・実現可能性研究バンティング ベスト糖尿病センター (BBDC)、H K に SickKids スタートアップ資金の補助金によって資金が供給されたこの作品医療研究センター プログラム (2015R1A5A2009124) を通じて国立研究財団の韓国 (NRF) 科学省、ICT、および将来計画 J R.K. によって資金を供給される s.
Materials
| LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
| PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
| TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
| DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
| F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | |||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Triton-X | |||
| Tween | |||
| Animal serum (goat, donkey) |
References
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