هذا البروتوكول يصف كيفية إنشاء نظام مراسل التي يمكن استخدامها لتحديد وتقدير حجم التفاعلات مستقبلات-يجند.
التفاعلات بين المستقبلات ويغاندس تشكل عملية بيولوجية أساسية. ومع ذلك، المباشر التجارب مع الخلايا التي تعبر عن مستقبلات الأصلية وتشكل تحديا يجند منذ يجند مستقبلات محددة قد تكون غير معروفة وإجراءات تجريبية مع يجند الأصلي يمكن أن يكون معقداً من الناحية الفنية. لتخطي هذه العقبات، يصف لنا نظام مراسل للكشف عن الملزمة والتنشيط مستقبلات محددة من يجند للفائدة. في هذا النظام مراسل، هو مترافق المجال خارج الخلية لمستقبلات محددة بالماوس CD3ζ وثم يتم التعبير عن هذا البروتين تشيميريك في خلايا الفأر الأسلحة البيولوجية. يمكن ثم تكون هذه الخلايا BW transfected المحتضنة مع أهداف مختلفة (مثلالخلايا أو الأجسام المضادة). التنشيط لمستقبل transfected يؤدي إلى إفراز interleukin-2 الماوس (mIL-2) التي يمكن الكشف عنها بواسطة المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (ELISA). وهذا النظام مراسل له مزايا حساسة ومحددة لمستقبل واحد. وبالإضافة إلى ذلك، مستوى التنشيط مستقبلات محددة يمكن قياسها كمياً بسهولة ويمكن استخدامها حتى في الحالات التي يكون فيها يجند المستقبلات غير معروف. وقد نفذت بنجاح هذا النظام في كثير من دراساتنا لوصف التفاعلات مستقبلات-يجند. وقد استخدمنا مؤخرا هذا النظام لدراسة تفعيل مستقبلات Fcγ البشرية (FcγRs) بالأجسام المضادة [مونوكلونل] مختلفة-CD20 في الاستخدام السريري.
نظام مراسل الحرب البيولوجية تقنية لدراسة التفاعلات مستقبلات-يجند1. هذا النظام مفيد خصوصا عندما يجند لمستقبل محدد غير معروف أو تجارب مع يجند الذاتية ويصعب من الناحية الفنية. يمكن استخدامه أيضا لدراسة الربط من الأجسام المضادة للبشرية FcγRs. ويستند الأسلوب معربا عن بروتين تشيميريك في خلايا الفأر الأسلحة البيولوجية. ويتألف هذا البروتين تشيميريك من المجال خارج الخلية من المستقبلات للفائدة التي تنصهر فيها إلى المجالات داخل الخلايا وترانسميمبراني من سلسلة ζ الماوس. ملزمة يغاندس المناسبة للمستقبلات يؤدي إلى إفراز الماوس إيل-2، التي يمكن بسهولة الكشف عنها بواسطة أليسا، كما هو مبين في الشكل 1. هذا الأسلوب حساسة ومحددة لمستقبلات فردية، سهلة التشغيل، واستنساخه بدرجة عالية. وهكذا فإنه يمكن أن تكمل أدوات إضافية لدراسة التفاعلات مستقبلات-يجند. على سبيل المثال، يمكن استخدام الكشف عن تفعيل FcγRs البشرية بالأجسام المضادة أو بواسطة مصل الدم البشري التي تحتوي على الفيروسات أو الشاشة عدة خطوط الخلية لوجود يجند لمستقبل معين (حتى ولو لم يتم تحديد يجند نفسه) الأجسام المضادة. على الرغم من أن الخلايا المناعية الأولية إكسبريس FcγRs الذاتية، وهم عموما من الصعب التعامل معها وعادة التعبير عن مستقبلات Fc عدة.
أننا استخدمنا هذا النظام بنجاح في كثير من دراساتنا لوصف التفاعلات مستقبلات-يجند. وتشمل هذه تحديد ضرورة كما يجند مستقبلات الخلية ناغورني كاراباخ NKp462، تحديد PVR ونيكتين-2 يغاندس للإنسان والفأر3،تيجت4، وتبين أن fusobacterium nucleatum يربط بكتيريا و ينشط تيجت البشرية5. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت خلايا الأسلحة البيولوجية التي تعبر عن مستقبلات Fc بنجاح للكشف عن الأجسام المضادة للفيروسات في المرضى سيرا6،،من78. على وجه التحديد، أنشأنا مؤخرا الخلايا البيولوجية التي تعبر عن FcγRs البشرية للكشف عن التنشيط FcR التفاضلية للأجسام المضادة-CD20 المستخدمة لعلاج سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL)9. الأهم من ذلك، وقد تم التحقق من صحة نتائج نظام مراسل الحرب البيولوجية في تجارب تكميلية.
نقدم هنا بروتوكولا لإنشاء نظام مراسل للتحقيق في التفاعلات مستقبلات-يجند (انظر شكل مختصر لهذا البروتوكول1). البروتوكول ويتكون من ثلاثة أجزاء رئيسية: استنساخ بروتين تشيميريك، الذي يشمل المجال خارج الخلية لمستقبلات محددة تنصهر فيها المجال داخل الخلايا من CD3ζ، تعداء بلازميد يعبر عن البروتين الانصهار لخلايا وزن الجسم (مثلاً ، من انهانسر)، والكشف عن كمية من الماوس إيل-2 قبل أليسا. وينبغي التحقق من المنتج النهائي لكل من هذه الأجزاء بشكل مستقل: ينبغي التحقق من عملية الاستنساخ بالتسلسل الكامل للبروتين الانصهار في بلازميد الهدف، ينبغي التحقق من تعداء الخلايا البيولوجية عن طريق فحص التعبير عن وينبغي التحقق من مستقبلات للفائدة في الخلايا البيولوجية (مثلاً، بالتدفق الخلوي)، وعملية أليسا الضوابط الإيجابية العامة (مثلاً، المؤتلف مل-2) وكذلك مع الضوابط المحددة للخلايا ترانسفيكتيد الأسلحة البيولوجية؛ أي الأهداف التي تعبر عن يجند معروفة من المستقبلات للفائدة (مثلاً، أن CD48 صريحة يمكن أن تستخدم كعنصر إيجابي للخلايا البيولوجية التي تعبر عن ناغورني كاراباخ في الخلية 2B4 مستقبلات الخلايا). على سبيل المثال، قد تكون عملية استنساخ ناجحة، ولكن البروتين الانصهار لا يعبر عن الخلايا البيولوجية. في هذه الحالة، يجب تكرار انهانسر. وبدلاً من ذلك، إذا لم يكن هناك أي إشارة على مستوى الخلفية لوحة أليسا (خاصة بالنسبة لعناصر التحكم الإيجابي) قد فشل transfected الخلايا البيولوجية للتعبير عن المستقبلات (أو التعبير قد فقدت) أو مشكلة تقنية قد تكون حدثت أثناء عملية أليسا.
يمكن أن تكون تعديلات عدة على هذا البروتوكول مع الحفاظ على المبادئ العامة للإجراءات. وتشمل هذه التعديلات متجه المستخدمة للتعبير عن البروتين الانصهار، طريقة ترانسفيكتينج بلازميد الخلايا البيولوجية ومعلمات محددة تتصل بالحضانة وإليزا مثل نوع الهدف (مثل الخلايا، والأجسام المضادة، إلخ) ، عدد من الخلايا المستهدفة أو تركيز الأجسام المضادة إذا ذات الصلة (ونحن نستخدم خلايا 50,000 كل جسم ابتداء من جرعة مقدارها 0.5 ميكروغرام/جيدا وكذلك)، وقت الحضانة (ونحن نستخدم فترة حضانة 48 ساعة) وطاف وحدة التخزين التي يتم نقلها إلى لوحة أليسا.
هذا الأسلوب حساسة، محددة ويمكن قياسها كمياً بسهولة. أنها مثالية للفحص لوجود يغاندس لمستقبلات محددة (خاصة إذا لم يعترف يجند نفسه). بعد إعداد transfected الخلايا البيولوجية التي تعبر عن مستقبلات محددة، يمكن تجميد هذه الخلايا وتستخدم عند الحاجة للمزيد من التجارب. نحن وآخرون قد استخدمت هذا النظام بنجاح في الدراسات السابقة لاستكشاف التفاعلات مستقبلات-يجند (على سبيل المثال2،،من35،،من1213،14 ،،من1516)، وقد تم التحقق من النتائج التي توصلت إليها هذا النظام بأساليب أخرى. يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب لدراسة تفعيل مستقبلات FcγR البشرية المختلفة من الأجسام المضادة، كما حدث لأجسام مضادة الفيروس في مصل الدم6،،من78 أو مع الأجسام المضادة ضد CD20 9.
أن هذا هو نظام مراسل الذي أعرب فيه عن الجزء خارج الخلية فقط للمستقبلات، النتائج التي تم الحصول عليها من هذا النظام ينبغي أن تستكمل بالمزيد من التجارب مع مستقبلات الذاتية، مثل فحوصات سيتوتوكسيسيتي مع الطبيعية الخلايا القاتلة (NK) لدراسة التفاعلات مع ناغورني كاراباخ الخلايا مستقبلات. وعلاوة على ذلك، بعض التفاعلات يجند/مستقبلات لا ينتج في إفراز mIL-2 منظومة مراسل، ولذلك قد أغفلت. وباﻹضافة إلى ذلك، كما هو الحال في أي برنامج الإعداد التجريبية، النتائج وينبغي التحقق من معلمات مختلفة كما هو موضح أعلاه. وهذا مهم بشكل خاص في الحالات التي يكون فيها مقارنة بين اثنين الشروط المطلوبة (مثلاً، تفعيل مستقبلات Fc نفسه من الأجسام المضادة المختلفة). من المهم أيضا التحقق من أن حساسية تفاعل مستقبلات يجند محددة داخل نطاق النظام الخطي. وإلا قد يؤدي ذلك إلى قيم التشبع الذي قد يحول دون إجراء مقارنة صحيحة عبر الشروط. يمكن تحقيق ذلك باستخدام منحنى قياسي 2 مل وكذلك عن طريق توليد منحنى استجابة لجرعة مع يجند مختبرة (في حالة تشبع القيم، التجريبية ينبغي أن يتم تعديل المعلمات؛ مثلاً، حجم أصغر من المادة طافية ينبغي تحليله بإليزا). آخر إمكانية الحد من هذا النظام هو استخدام الخلايا المستهدفة مع الإفرازات الذاتية لشركة مالونغوشي-2 (مثلاً، خلايا الفأر T) التي يمكن أن يخفيها إفراز الخلايا BW إيل-2. للتغلب على هذه الأحداث عادية جداً التي تقتصر على خلايا الماوس، يمكن تحسين هذا النظام المراسل باستخدام مراسل مختلفة (مثلاً، التجارة والنقل) التي لا يعبر عنها بواسطة الخلايا الهدف.
The authors have nothing to disclose.
يشكر المؤلفون المغنية إستر لتحرير اللغة. هذه الدراسة وأيده “مجلس البحوث الأوروبية” ضمن “البرنامج الإطاري السابع” للاتحاد الأوروبي (FP/2007-2013)/”منسق المنحة” رقم 320473-باكنك. وقدم المزيد من الدعم البرنامج “لجنة الميزنة” والتخطيط و “مؤسسة العلوم إسرائيل” أنا–الأساسية، وأنا-الأساسية في الكروماتين، والجيش الملكي النيبالي في تنظيم الجينات، ومؤسسة GIF، مؤسسة الأسرة لويس، منحة الأستاذية إيكرف، منح إسرائيل هلمهولتز والثقة روسيتريس (وجميعها إلى أ). وأيد هذه الدراسة أيضا “مؤسسة العلوم إسرائيل” (منحة 502/15)، “جائزة كأس للبحوث الطبية” ومنحة بحثية من المجتمع الإسرائيلي من أمراض الدم وطب نقل الدم (إلى S.E). O.M أستاذ “علم المناعة الجزيئية” تاج.
AccuPrep, Plasmid Mini Extraction Kit | Bioneer | K-3030 | |
Anti-mouse IL-2 | BioLegend | 503702 | |
Biotin anti-mouse IL-2 | BioLegend | 503804 | |
ELISA plates | De-groot | 60-655061 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F7524-500ml | |
G418 | Mercury | MBS3458105GM | |
Gene Pulser II | Bio-Rad | 165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110 | |
L-Glutamine | Biological industry | 03-020-1B | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Biological industry | 01-340-1B | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Biological industry | 03-031-1B | |
peroxidase streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | |
PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit | ThermoFisher Scientific | K210016 | |
RPMI-1640 Medium | Biological industry | 30-2001 | |
Sodium Pyruvate | Biological industry | 03-042-1B | |
TMB | SouthernBiothech | 0410-01 |