Det här protokollet beskriver hur du upprättar en reporter system som kan användas för att identifiera och kvantifiera receptor-ligand interaktioner.
Interaktioner mellan receptorer och ligander utgör en grundläggande biologisk process. Dock direkt experiment med celler som uttrycker den infödda receptorn och liganden är utmanande eftersom liganden av en specifik receptor kan vara okända och experimentella rutiner med infödda liganden kan vara tekniskt komplicerat. För att lösa dessa hinder, beskriver vi en reporter systemet för att upptäcka den bindning och aktivering av en specifik receptor av en ligand av intresse. I denna reporter systemet, det extracellulära området av en specifik receptor är konjugerat med musen CD3ζ och denna chimär proteinet uttrycks sedan i mus BW celler. Dessa transfekterade BW-celler kan sedan inkuberas med olika mål (t.ex., celler eller antikroppar). Aktivering av en transfekterade receptor leder till utsöndring av mus interleukin-2 (mIL-2) vilket kan upptäckas genom enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Denna reporter systemet har fördelarna med att vara känsliga och specifika till en enda receptor. Dessutom nivån aktiveringen av en specifik receptor kan enkelt kvantifieras och kan användas även i fall då liganden av receptorn är okänd. Detta system har genomförts framgångsrikt i många av våra studier att karakterisera receptor-ligand interaktioner. Vi har nyligen anställt detta system att studera aktivering av mänskliga Fcγ-receptorer (FcγRs) av olika monoklonala anti-CD20-antikroppar vid klinisk användning.
BW reporter systemet är en teknik för att studera receptor-ligand interaktioner1. Detta system är speciellt fördelaktigt när liganden av en specifik receptor är okänd eller experiment med endogena liganden är tekniskt svårt. Det kan också användas för att studera bindningen av monoklonala antikroppar mot mänskliga FcγRs. Metoden bygger på att uttrycka en chimär protein i mus BW celler. Detta chimära protein består av det extracellulära området av receptorn sevärdheter smält till de transmembrana och intracellulära domänerna i kedjan mus ζ. Bindning av lämpliga ligander av receptorn leder till utsöndring av mus IL-2, som enkelt kan upptäckas av ELISA, som illustreras i figur 1. Denna metod är känsliga och specifika för en enskild receptorn, lätt att använda, och mycket reproducerbara. Det kan således komplettera ytterligare verktyg för att studera receptor-ligand interaktioner. Till exempel, kan det användas till skärmen flera cellinjer för förekomsten av en ligand för en specifik receptor (även om liganden själv inte har identifierats) eller till upptäcka aktiveringen av mänskliga FcγRs av monoklonala antikroppar eller humant serum som innehåller anti-virala antikroppar. Även primära immunceller express endogena FcγRs, är de generellt svåra att hantera och oftast uttrycka flera Fc receptorer.
Vi har använt detta system framgångsrikt i många av våra studier för att karakterisera receptor-ligand interaktioner. Dessa inkluderar att identifiera hemagglutinin som liganden av NK cell receptorn NKp462, identifiera PVR och nectin-2 som ligander för mänskliga och mus TIGIT3,4, och visar att den fusobacterium nucleatum bakterien binder och aktiverar mänskliga TIGIT5. BW-celler som uttrycker Fc receptorer har dessutom använts framgångsrikt att upptäcka antivirala antikroppar i patienternas sera6,7,8. Specifikt, etablerade vi nyligen BW celler som uttrycker människors FcγRs för att upptäcka differentiell FcR aktivering av anti-CD20-antikroppar som används för behandling av kronisk lymfatisk leukemi (KLL)9. Ännu viktigare, har resultaten av BW reporter systemet validerats i kompletterande experiment.
Här presenterar vi ett protokoll för att generera en reporter systemet för att undersöka receptor-ligand interaktioner (se en förkortad form av detta protokoll i1). Protokollet består av tre huvuddelar: kloning av en chimär protein, som innehåller det extracellulära området av en specifik receptor smält CD3ζ, transfection av en plasmid som uttrycker proteinet fusion till BW celler intracellulära domän (t.ex. , av elektroporation), och kvantitativa upptäckt av mus IL-2 med ELISA. Den slutliga produkten av varje av dessa delar bör kontrolleras oberoende av varandra: kloning processen bör kontrolleras av komplett sekvensering av proteinet fusion i målet plasmiden, transfection BW celler bör verifieras genom att undersöka uttrycket av den receptorn sevärdheter i BW cellerna (t.ex., av flödescytometri) och ELISA processen bör kontrolleras av allmänna positiva kontroller (t.ex., rekombinant mIL-2) samt med särskilda kontroller för BW transfekterade cellerna; d.v.s. mål som uttrycker en känd ligand av receptorn av intresse (t.ex., celler att uttryckliga CD48 kan användas som en positiv kontroll för BW celler som uttrycker NK cell receptor 2B4). Till exempel kloning processen kan vara framgångsrika, men fusion proteinet uttrycks inte av BW celler. I det här fallet bör elektroporation upprepas. Alternativt, om ingen signal över bakgrundsnivån i ELISA-plattan (särskilt för de positiva kontrollerna) BW transfekterade cellerna kan ha misslyckats att uttrycka receptorn (eller uttrycket har gått förlorad) eller ett tekniskt problem kan ha uppstått under ELISA processen.
Flera ändringar kan göras till detta protokoll samtidigt som de allmänna principerna i förfarandet. Dessa ändringar inkluderar den vektor som används för att uttrycka proteinet fusion, metoden för transfecting plasmiden BW celler och specifika parametrar relaterade till inkubation och ELISA såsom typ av mål (t.ex. celler, antikroppar, etc.) , antal målceller eller antikroppkoncentrationen om relevanta (vi använder 50.000 celler per brunn och en antikropp startdosen av 0,5 µg per brunn), inkubationstiden (vi använda en inkubationstid av 48 h) och volymen supernatant som överförs till ELISA-plattan.
Denna metod är känslig, specifika och enkelt kan kvantifieras. Den är idealisk för screening för förekomst av ligander för specifika receptorer (särskilt om liganden själv inte har erkänts). Efter beredning transfekterade BW-celler som uttrycker en specifik receptor, kan dessa celler frysas och användas när det behövs för ytterligare experiment. Vi och andra har använt detta system framgångsrikt i tidigare studier för att utforska receptor-ligand interaktioner (till exempel2,3,5,12,13,14 15,16) och resultaten av detta system har verifierats av andra tekniker. Denna metod kan också användas för att studera aktivering av olika mänskliga FcγR receptorer av antikroppar, som har gjorts för antivirala antikroppar i serum6,7,8 eller med monoklonala antikroppar mot CD20 9.
Eftersom detta är en reporter systemet där endast det extracellulära segmentet av receptorn uttrycks, bör resultaten erhållits genom detta system kompletteras med ytterligare experiment med endogena receptorn, såsom cytotoxicitet analyser med naturlig mördarceller (NK) att studera interaktioner med NK cell receptorer. Dessutom vissa ligand/receptor interaktioner kan inte resultera i en mIL-2 sekretion av reporter systemet, och därför kan förbises. Liksom alla experimentella setup, bör dessutom resultaten verifieras för olika parametrar som beskrivs ovan. Detta är särskilt viktigt i de fall en jämförelse av två villkor är nödvändiga (t.ex., aktivering av samma Fc receptor av olika antikroppar). Det är också viktigt att kontrollera att känsligheten hos en specifik ligand-receptor interaktionen är inom linjär spänna av systemet. Detta kan annars leda till mättnadsvärden vilket utesluter en giltig jämförelse över villkoren. Detta kan uppnås genom att använda en mIL-2 standardkurva samt genom att skapa en dos-respons kurva med testade liganden (när det gäller mättar värden, de experimentella parametrarna bör ändras. t.ex., en mindre volym av supernatanten bör analyseras med ELISA). En annan möjlig begränsning av detta system är användning av målceller med endogena sekret av mIL-2 (t.ex., mus T celler) som skulle dölja de IL-2 sekretionen av BW celler. För att övervinna dessa mycket ovanliga händelser som är begränsade till mus celler, kan reporter systemet förbättras genom att använda en annan reporter (t.ex., GFP) som inte uttrycks av målceller.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Esther Singer för språkgranskning. Denna studie stöddes av Europeiska forskningsrådet under EU: s sjunde ramprogram (FP/2007-2013) / ERC bidragsavtalet nummer 320473-BacNK. Ytterligare stöd tillhandahölls av jag-kärnan Program planering och budgetering kommittén och stiftelsen Israel vetenskap och jag-kärnan på kromatin och RNA i genreglering, Stiftelsen GIF, Stiftelsen familjen Lewis, föreståndare professur bidraget, det Helmholtz Israel grant och Rosetrees förtroende (alla O.M.). Denna studie stöddes också av Israel Science Foundation (grant 502/15), utmärkelsen Kass medicinsk forskning och ett forskningsanslag från Israel samhället för hematologi och transfusionsmedicin (till Birgitta). Olsson är Crown professor i molekylär immunologi.
AccuPrep, Plasmid Mini Extraction Kit | Bioneer | K-3030 | |
Anti-mouse IL-2 | BioLegend | 503702 | |
Biotin anti-mouse IL-2 | BioLegend | 503804 | |
ELISA plates | De-groot | 60-655061 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F7524-500ml | |
G418 | Mercury | MBS3458105GM | |
Gene Pulser II | Bio-Rad | 165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110 | |
L-Glutamine | Biological industry | 03-020-1B | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Biological industry | 01-340-1B | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Biological industry | 03-031-1B | |
peroxidase streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | |
PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit | ThermoFisher Scientific | K210016 | |
RPMI-1640 Medium | Biological industry | 30-2001 | |
Sodium Pyruvate | Biological industry | 03-042-1B | |
TMB | SouthernBiothech | 0410-01 |