Identifikation af kodning og ikke-kodende RNA klasser udtrykt i svin fuldblod
Summary
Her præsenterer vi en protokol optimeret til behandling af kodning (mRNA) og ikke-kodende (ncRNA) globin reduceret RNA-seq biblioteker fra en enkelt hele blodprøve.
Abstract
Fremkomsten af innovative og stadig mere magtfulde næste generation sequencing teknikker har åbnet nye veje ind i mulighed for at undersøge de underliggende genekspression relateret til biologiske processer af interesse. Disse innovationer ikke kun give forskere at observere udtryk fra mRNA sekvenser, som kode for gener at virkning cellefunktion, men også de ikke-kodende RNA (ncRNA) molekyler, der forbliver utranslaterede, men stadig have myndighedsopgaver. Selv om forskerne har evnen til at observere både mRNA og ncRNA udtryk, har det været sædvane for en undersøgelse for at fokusere på ene eller den anden. Men når undersøgelser er interesseret i både mRNA og ncRNA udtryk, mange gange de bruger separate prøver for at undersøge enten kodning eller ikke-kodende RNA’er på grund af forskellen i biblioteket præparater. Dette kan føre til behovet for flere prøver, som kan øge tid, hjælpematerialer og dyrenes stress. Derudover kan det forårsage forskere til at beslutte at forberede prøverne for kun én analyse, normalt mRNA, begrænse antallet af biologiske spørgsmål, der kan undersøges. Dog span klarlægning flere klasser med regulerende roller at virkning mRNA udtryk. Fordi ncRNA er vigtige for grundlæggende biologiske processer og forstyrrelse af disse processer i under infektion, kan de derfor foretage attraktive mål for therapeutics. Dette håndskrift, viser en modificeret protokol for generation mRNA og ikke-kodende RNA udtryk biblioteker, herunder viral RNA, fra en enkelt prøve af fuldblod. Optimering af denne protokol, forbedret RNA renhed, øget ligatur for inddrivelse af methylerede RNA’er og udeladt størrelse udvælgelse, for at tillade fangst af flere arter, RNA.
Introduction
Næste generation sequencing (NGS) fremstod som et kraftfuldt værktøj til undersøgelse af de ændringer, der opstår på genomisk niveau af biologiske organismer. Prøveforberedelse til NGS metoder kan varieres afhængigt af organismen, vævstype, og endnu vigtigere spørgsmål forskerne er ivrige efter at adresse. Mange undersøgelser har vist at NGS som et middel til at studere forskellene i genekspression mellem stater som raske og syge personer1,2,3,4. Sekventering tage sted på grundlag af samlede genom og giver mulighed for en forsker at fange mest, hvis ikke alle genomisk oplysninger for en bestemt genetiske markør på et tidspunkt punkt.
De mest almindelige markører ytringsfriheden observeret er messenger RNA’er (mRNAs). De mest anvendte procedurer for prepping biblioteker for RNA-seq er optimeret til genopretning af mRNA molekyler ved hjælp af en række purifications, opdelinger og ligations5,6. Dog beslutningen om hvordan en protokol er der skal udføres er stærkt afhængig af prøvetypen og spørgsmålene om nævnte stikprøve. I de fleste tilfælde er total RNA ekstraheret; men ikke alle RNA molekyler er af interesse og i sager som mRNA udtryk undersøgelser alt for rigelige RNA arter, som ribosomale RNA’er (rRNA) skal fjernes for at øge antallet af påviselige udskrifter tilknyttet mRNAs. De mest populære og udbredte metode til at fjerne de rigelige rRNA molekyler er reduktion af polyadenylated RNA udskrifter omtales som polyA udtømning7. Denne metode fungerer godt for analysen af mRNA udtryk da det ikke påvirker mRNA udskrifter. I undersøgelser, der er interesseret i ikke-kodende eller viral RNA’er, fjerner polyA udtynding også disse molekyler.
Mange undersøgelser vælger at fokusere på RNA sekvens bibliotek forberedelse at undersøge enten mRNA udtryk (kodning) eller en bestemt klasse af små eller store ikke-kodende RNA. Selv om der er andre procedurer8 som vores, der giver mulighed for den dobbelte prøveforberedelse, forberede mange undersøgelser biblioteker fra separate prøver på separate undersøgelser når det er tilgængeligt. For en undersøgelse som vores, ville dette normalt kræve flere blodprøver stigende tid, hjælpematerialer og dyrenes stress. Målet med vores undersøgelse var at bruge fuldblod fra dyr til at identificere og kvantificere de forskellige klasser af både mRNA og ikke-kodende RNA udtrykt mellem sund og højpatogen porcint reproduktions- og luftvejssyndrom virus (HP-PRRSV) udfordret svin9,10 trods kun en enkelt fuldblod prøve (2,5 mL) fra hvert svin. For at gøre dette, vi havde brug at optimere de typiske udvinding og bibliotek oprettelsen protokoller til at generere de relevante data til analyse af både mRNA og ikke-kodende RNA (ncRNA) udtryk11 fra en enkelt prøve.
Det fik brug for en protokol, der er tilladt for mRNA og ikke-kodende RNA analyse, fordi de tilgængelige standard kits og metoder til oprettelse af RNA-udvinding og bibliotek var hovedsageligt tiltænkt mRNA og bruge en poly-en udtynding trin12. Dette trin ville have gjort det umuligt at gendanne ikke-kodende RNA eller viral udskrifter fra prøven. Derfor, en optimeret metode var nødvendig at tilladt for total RNA udvinding uden prøve polyA udtynding. Metoden fremlægges i dette håndskrift er blevet optimeret til at tillade brugen af fuldblod som en prøvetypen og opbygge sekventering biblioteker for både mRNA og klarlægning af små og store størrelser. Metoden er blevet optimeret for at give mulighed for analyse af alle påviselige ikke-kodende RNA’er samt bevare viral RNA’er til senere undersøgelse13. I alt vores optimeret bibliotek forberedelse protokol giver mulighed for undersøgelse af flere RNA molekyler fra en enkelt hele blodprøve.
Det overordnede mål bag brugen af denne metode var at udvikle en proces, der er tilladt for samling af både ikke-kodende RNA og mRNA fra én prøve med fuldblod. Dette tillader os at have mRNA, ncRNA og viral RNA for hvert dyr i vores undersøgelse, stammer fra en enkelt prøve9. Dette, i sidste ende giver mulighed for mere videnskabelig opdagelse uden yderligere omkostninger til dyr og giver en mere komplet billede af udtryk for hver enkelt prøve. Den beskrevne metode giver mulighed for undersøgelse af regulatorer af genekspression samt giver mulighed for færdiggørelsen af korrelationsmaalinger undersøgelser sammenligning begge mRNA og ikke-kodende RNA udtryk ved hjælp af en enkelt hele blodprøve. Vores undersøgelse anvendes denne protokol til at undersøge ændringerne i genekspression og mulige epigenetiske lovgivere i viralt inficerede 9 – uger gamle mandlige kommercielle svin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det første vigtige skridt i den protokol, der gjorde det optimeret inkluderet ekstra globin udtynding trin, som gjorde det muligt at få kvalitet læsninger fra hele blodprøver. En af de største begrænsninger på ved hjælp af fuldblod i sekventering undersøgelser er det høje antal læsninger i stikprøven, vil knytte til globin molekyler og reducere de læser, der kan knyttes til andre molekyler af interesse18. Derfor, i optimering af protokollen for vores prøvetype, vi havde brug at indar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde var primært støttet af den af USDA NIFA AFRI 2013-67015-21236, og dels af USDA NIFA AFRI 2015-67015-23216. Denne undersøgelse var delvist understøttet af en aftale i landbruget forskning Service forskning deltagelse programmet administreres af Oak Ridge Institut for videnskab og uddannelse (ORISE) gennem en tværinstitutionelle aftale mellem os Department of Energy ( DOE) og US Department of Agriculture. ORISE er forvaltes af Oak Ridge associeret universiteter under DOE kontrakt ikke. DE-AC05-06OR2310.
Vi vil gerne takke Dr. Kay Faaberg for HP-PRRSV smitsomme kloner, Dr. Susan Brockmeier for hendes hjælp dyrene involveret i eksperimentet og Sue Ohlendorf for sekretærservice bistand under forberedelse af manuskriptet.
Materials
| PAXgene Tubes | PreAnalytix | 762165 | |
| Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| mirVana miRNA Isolation Kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| Rneasy MinElute Clean Up Kit | QIAGEN | 74204 | |
| 100% Ethanol | Decon Labs, Inc. | 2716 | |
| 0.2 mL thin-walled tubes | ThermoFisher | 98010540 | |
| 1.5 mL RNase/DNase – free tubes | Any supplier | ||
| Veriti 96-well Thermocycler | ThermoFisher | 4375786R | |
| Globin Reduction Oligo (α 1) | Any supplier | Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT | |
| Globin Reduction Oligo (α 2) | Any supplier | Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA | |
| Globin Reduction Oligo (β 1) | Any supplier | Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT | |
| Globin Reduction Oligo (β 2) | Any supplier | Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT | |
| 10X Oligo Hybridization Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -KCl | Millipore Sigma | 60142-100ML-F | |
| 10X RNase H Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -DTT | ThermoFisher | Y00147 | |
| -MgCl2 | Promega | A351B | |
| -Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| RNase H | ThermoFisher | AM2292 | |
| SUPERase-IN | ThermoFisher | AM2694 | Rnase inhibitor |
| EDTA | Millipore Sigma | E7889 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| 2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2938C | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero | Illumina | RS-122-2201 | mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A (48 samples, 12 indexes) |
| TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide | Illumina | Available on-line | |
| RNAClean XP Beads | BeckmanCoulter | A63987 | |
| AMPure XP Beads | BeckmanCoulter | A63880 | |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip | ThermoFisher | N8010580 | 0.2 ml thin-walled tubes |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap | ThermoFisher | N801-0535 | |
| RNase/DNase – free reagent reservoirs | Any supplier | ||
| SuperScript II Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18064-014 | |
| MicroAmp Optical 96 well plates | ThermoFisher | N8010560 | These were used in place of .3mL plates as needed |
| MicroAmp Optical adhesive film | ThermoFisher | 4311971 | |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1) | New England Biolabs | E73005 | small RNA kit |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2) | New England Biolabs | E75805 | small RNA kit |
| QIAQuick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| 96S Super Magnet Plate | ALPAQUA | A001322 |
References
- Finotello, F., Di Camillo, B. Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).
- Coble, D. J., et al. RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature. BMC Genomics. 15, 1084 (2014).
- Koltes, J. E., et al. Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection. BMC Genomics. 16, 412 (2015).
- Miller, L. C., et al. Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli. PLoS One. 12 (7), 0181256 (2017).
- Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).
- Fleming, D. S., Miller, L. C. Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection. Virology. 517, 56-61 (2018).
- Fleming, D. S., Miller, L. C. Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV). Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), (2018).
- Bivens Nathan, J., Zhou, M. RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis. Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).
- Cui, P., et al. A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing. Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).
- Guo, Y., et al. RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library. BioMed Research International. 2015, 9 (2015).
- Choi, I., et al. Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples. BMC Genomics. 15, 954 (2014).
- . TruSeq® Stranded Total RNA Sample Preparation Guide. Illumina. , (2018).
- . New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560) Available from: https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg (2018)
- Shin, H., et al. Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion. PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).
- Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA–novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).
