וזמינותו תחבורה אופסין # רודופסין על ידי ניתוח גבוהה-תוכן הדמיה
Summary
כאן, אנחנו תיאר שיטה הדמיה גבוהה-תוכן לכמת התעבורה של מוטציות אופסין # רודופסין הקשורים עם רטיניטיס פיגמנטוזה. ניתוח התוצאות מרובות באורך הגל שימש לכמת אופסין # רודופסין החלבון על פני התא או את כל התא.
Abstract
אופסין # רודופסין מוטציות misfolding להוביל למוות קולט אור רוד, הבא לידי ביטוי כמו אוטוזומלית דומיננטית רטיניטיס פיגמנטוזה (RP), מתקדמים מסנוור מחלות חסר טיפול יעיל. אנו משערים כי ניתן להקל את cytotoxicity של המוטציה misfolded אופסין # רודופסין על-ידי פרמקולוגית ייצוב החלבון המוטנטי אופסין # רודופסין המוטציה P23H, בין שאר Class II אופסין # רודופסין מוטציות, מקודד חלבון מוטנט יציב מבחינה מבנית אופסין # רודופסין המצטבר בתוך-פלזמית (ER), ואילו אופסין # רודופסין פראי סוג מועבר קרום פלזמה ב מידע יונקים תאים. אנו בעבר ביצע מסך תפוקה גבוהה המבוססת על הפריה חוץ גופית (HTS), זיהה קבוצת מלווים תרופתי הציל הובלת P23H אופסין # רודופסין מ אר אל קרום פלזמה. כאן, אנחנו באמצעות שיטת immunostaining ואחריו ניתוח ההדמיה גבוהה-תוכן, לכמת את כמות חלבון מוטציה אופסין # רודופסין את כל התא ועל קרום פלזמה. בשיטה זו הוא אינפורמטיבי ויעיל לזהות פגיעות נכון מכל תוצאות חיוביות שגויות בעקבות HTS. בנוסף, הניתוח גבוהה-תוכן התמונה אפשרה לנו לכמת פרמטרים מרובים מניסוי יחיד כדי להעריך את תכונות פרמקולוגיות של כל המתחם. שימוש assay הזה, ניתחנו את ההשפעה של תרכובות שונות 11 לכיוון שש המוטציות אופסין # רודופסין RP הקשורים, קבלת פרופיל תרופתי דו-ממדי עבור הבנה כמותיים ואיכותיים ביציבות הקונסטרוקטיבית של המוטנטים האלה אופסין # רודופסין והיעילות של תרכובות שונות כלפי המוטנטים האלה.
Introduction
חלבון misfolding מעורב ב ניוון שרירים, degenerations עצבית, כמו גם מחלות מסנוור, כולל רטיניטיס פיגמנטוזה (RP)1. RP היא תורשתית ומתקדמת ניוון הרשתית המשויך מוטציות בגנים מעל 60 המשפיעים על תפקוד על הומאוסטזיס של רוד photoreceptors או2,epitheliums פיגמנט הרשתית (RPEs)3. אין טיפול יעיל זמין כעת עבור RP. אופסין # רודופסין מוטציות בחשבון כ 25-30% אוטוזומלית דומיננטית (ad) מקרים RP. בין יותר מ-150 אופסין # רודופסין מוטציות4 (האדם גנים מוטציה מסד נתונים, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), מוטציות Class II לגרום לחוסר יציבות מבנית את החלבון אופסין # רודופסין תורם למוות קולט אור רוד, חזון הפסד5,6,7,8. P23H הוא המוטציה אופסין # רודופסין בתדירות הגבוהה ביותר בצפון אמריקה, שהוא גם דוגמה טיפוסית של9,10מוטציות אופסין # רודופסין Class II. עקב יציבות מבנית, הטבועה שלה אופסין # רודופסין misfolded שנצבר ב רשתית תוך-פלזמית (ER) בתאי יונקים, ואילו אופסין # רודופסין פראי סוג ממוקם על קרום פלזמה5. אופסין # רודופסין P23H המוצגים מוטציה דומיננטית שלילי cytotoxicity ואינו haploinsufficiency, אך קשורה את ההפעלה של ER misfolded קשורה חלבון השפלה מסלול וארגון החיצוני קטע קטע מוט. כדי להקל על מוט מתח התא קולט אור, אסטרטגיה אחת היא לייצב קיפול מקורית של מוטציה אופסין # רודופסין באמצעות מלווה תרופתי.
כדי להשיג מטרה זו, ביצענו עם מסך מבוססי תאים תפוקה גבוהה (HTSs)11,12,13 שימוש assay קומפלמנטציה פרגמנט β-galactosidase לכמת אופסין # רודופסין P23H המוטציה מועבר על מסך הפלזמה ממברנה. פרוטוקול פשוט ועמיד assay HTS זו אפשרה לנו לבחון את הפעילות של מולקולות קטנות בערך 79,000 על כל מסך. עם זאת, מכיוון assay HTS הזה קורא אותות הפריה חוץ גופית, תוצאות חיוביות שגויות, כולל את מעכבי β-גל, תרכובות בצבע או ציטוטוקסיות כלולים ברשימת החיסול מחכה להיות מזוהה על ידי assay המשני.
Immunostaining המסורתי של שיטות הדמיה פלורסצנטיות שימשו במשך שנים ללמוד התעבורה אופסין # רודופסין תאים בתרבית של5,14,15,16. עם זאת, השיטות המקובלת לא ניתן להשתמש כדי לכמת תרופתי אפקטים של יותר מ- 10 תרכובות לכיוון אופסין # רודופסין התחבורה כי ניתוח ההדמיה אמין דורש מספר רב של תמונות לפי תנאי מאוד עקבית, אשר לא amendable על ידי שיטות הדמיה קונבנציונלי. . הנה, פיתחנו פרוטוקול הדמיה של high-תוכן immunostaining מבוסס כמו assay המשני לכמת התעבורה פני שטח התא של אופסין # רודופסין misfolded מוטציות11,13,17. להוספת תווית אופסין # רודופסין על קרום פלזמה, דילגנו השלב של קרום התא permeabilization ו- immunostained המוטנטים אופסין # רודופסין מאת monoclonal (B6-30) נגד אופסין # רודופסין לזהות את epitope N-מסוף של אופסין # רודופסין לצד חוץ-תאי של התא 18. כדי להמחיש את המוטציות אופסין # רודופסין התא כולו, אנחנו התמזגו אופסין # רודופסין עם החלבון זריחה נוגה. מאת כימות של עוצמות קרינה פלואורסצנטית בערוצים שונים פלורסצנטיות, אנו מסוגלים לקבל פרמטרים מרובים מהניסוי בודד אחד, כולל עוצמת אופסין # רודופסין הכולל כל התא, על פני השטח של התא, ואת היחס של אופסין # רודופסין זריחה על פני התא לזה התא כולו. יישום שיטה זו יציב התאים לבטא סכום כולל של 6 misfolded אופסין # רודופסין מוטציות, אנחנו ניתן להפיק פרופיל תרופתי של משגיחים מרובים מולקולה קטנה לכיוון המוטנטים האלה. ב פרוטוקול זה, כל התאים immunostained בצלחת 384-. ובכן, עם תמונה באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית בתנאי הדמיה מאוד עקבי. ניתוח התמונה מתבצע כדי כל טוב, המכיל תמונות של יותר מ-600 תאים כדי להפחית וריאציה בשל הטרוגניות התאים עם משתנה צורת התא ורמת ביטוי חלבון. זרימת העבודה של פרוטוקול זה מסוכם באיור1. היתרון של שיטה זו הוא כי אנו משיגים תמונות ברזולוציה גבוהה, כמו גם פרמטר מרובה quantifications מניתוח המבוססת על תמונה. באופן כללי, פרוטוקול זה יכול להיות שונה ומוחלים לכמת את התעבורה של כל חלבון ממברנלי misfolded של עניין.
Protocol
Representative Results
Discussion
. הראנו assay הדמיה של high-תוכן המשמש אפיון בנפילות שאותרו מן HTS. אוטומציה היחידה מעורב פרוטוקולים אלה הוא הצלם גבוה-תוכן. Immunostaining ואת פלורסצנטיות הדמיה של אופסין # רודופסין היו בשימוש נפוץ לאפיין הלוקליזציה של אופסין # רודופסין5,14,15,<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ד ר מארק אי Schurdak, גילוי תרופות אוניברסיטת פיטסבורג מכון למתן imager גבוהה-תוכן והדרכה ראשונית. ד ר קז’ישטוף Palczewski (Case Western Reserve University) משותף בנדיבות את 4 1D ונוגדנים אנטי אופסין # רודופסין B630. פלסמיד המכיל את cDNA של העכבר אופסין # רודופסין-ונוס לבנות היה משותף על ידי ד ר נבין למברט (אוניברסיטת Augusta). עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי של בריאות גרנט EY024992 שיקו לוי, P30EY008098 של אוניברסיטת פיטסבורג החזון לחקר הליבה גרנט.
Materials
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
References
- Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. Protein misfolding and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).
- Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Stenson, P. D., et al. The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).
- Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).
- Athanasiou, D., et al. The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).
- Chiang, W. C., et al. Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration. Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).
- Sakami, S., et al. Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).
- Dryja, T. P., et al. Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa. New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).
- Sohocki, M. M., et al. Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies. Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).
- Chen, Y., et al. A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Chen, Y., Tang, H. High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation. Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).
- Chen, Y., et al. A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).
- Noorwez, S. M., et al. Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).
- Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation. Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).
- Kaushal, S., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Biochemistry. 33 (20), 6121-6128 (1994).
- Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa. Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).
- Adamus, G., et al. Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application. Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), (2010).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Bray, M. A., Carpenter, A., Sittampalam, G. S. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. Assay Guidance Manual. , (2004).
- Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain. Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).
- Krebs, M. P., et al. Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue. Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).
