이 콘텐츠 이미징 분석 Rhodopsin 전송 분석 결과
Summary
여기, 우리는 계량의 rhodopsin 돌연변이 망막 화와 관련 된 전송 하는 콘텐츠 이미징 방법을 설명 합니다. 다중 파장 득점 분석 rhodopsin 단백질 세포 표면에 또는 전체 셀에서 계량에 사용 되었다.
Abstract
Rhodopsin misfolding 돌연변이 상 염색체 지배적인 망막 화 (RP), 효과적인 치료 부족 질병 눈부신 진보로 각 성 하는 로드 포토 리셉터 죽음으로 이어질. 우리가 가설을 misfolded rhodopsin 돌연변이의 세포 독성 약리학 돌연변이 rhodopsin 단백질 안정화에 의해 완화 될 수 있다. P23H 돌연변이 다른 클래스 II rhodopsin 변이 중 인코딩합니다 구조적으로 불안정 rhodopsin 돌연변이 단백질을 바인딩과 그물 (ER)에 누적 된 반면 야생 타입 rhodopsin 포유류에 플라즈마 막에 수송 된다 셀입니다. 우리는 이전 발광 기반 높은 처리량 화면 (HTS)을 수행 하 고 응급실에서 원형질 막의 P23H rhodopsin의 전송 구조 약리 보호자의 그룹을 식별. 돌연변이 rhodopsin 단백질 금액과 전체 세포에서 원형질 막에는 여기, 정량이 콘텐츠 이미징 분석 다음 immunostaining 메서드를 사용 하 여, 우리. 이 메서드는 유익 하 고 가양성 HTS. 다음에서 진정한 안타를 식별 하는 효과적인 또한,이 콘텐츠 이미지 분석 계량 각 화합물의 약리 속성을 평가 하는 하나의 실험에서 여러 매개 변수를 사용할 수 있습니다. 이 분석 결과 사용 하 여, 우리 6 RP 관련 rhodopsin 돌연변이, 이러한 rhodopsin 돌연변이의 구조적 안정성에 대 한 양적 및 질적 이해에 대 한 2 차원 약리 프로필을 얻는 쪽으로 11 다른 화합물의 효과 분석 그리고 이러한 돌연변이 향해 다른 화합물의 효능입니다.
Introduction
단백질 misfolding은 근이 영양 증, 신경 유년으로 망막 화 (RP)1를 포함 하 여 눈부신 질병에 관여. RP 상속 및 진보적인 망막 변성 기능과 항상성 막대 대뇌 또는 망막 안료 epitheliums (RPEs)2,3에 영향을 미치는 60 개 이상의 유전자에 돌연변이와 관련 된입니다. 효과적인 치료는 현재 RP에 대 한 합니다. Rhodopsin 돌연변이 RP의 경우 상 염색체 지배 (광고)의 약 25-30%를 위한 계정. 150 이상 rhodopsin 돌연변이4 (인간의 유전자 돌연변이 데이터베이스, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), 중 클래스 II 돌연변이 로드 포토 리셉터 죽음에 기여 rhodopsin 단백질의 구조적 불안정의 원인이 고 시력 손실5,6,,78. P23H 이다 북아메리카에 있는 가장 빈번한 rhodopsin 돌연변이 또한 클래스 II rhodopsin 돌연변이9,10의 전형적인 예. 그것의 고유한 구조 불안정으로 인해 misfolded rhodopsin는 야생 타입 rhodopsin 원형질 막5에 위치 하 고 있습니다 반면 포유류 세포에서 바인딩과 그물 (ER)에 축적 됩니다. Misfolded rhodopsin P23H 돌연변이 전시 지배적인 부정적인 세포 독성 haploinsufficiency, 때문만 아니다 하지만 응급실의 활성화로 관련 단백질 강 직 통로 중단된 막대 외부 세그먼트 조직 관련. 로드 포토 리셉터 세포 스트레스 완화, 한 전략 약리 보호자를 사용 하 여 돌연변이 rhodopsin의 네이티브 접는 안정화 하는.
이 위해 우리는 높은 처리량 화면 셀 기반 (HTSs)11,12,13 P23H rhodopsin 돌연변이 플라즈마에 이송 계량 하는 β-galactosidase 조각 보완성 분석 결과 사용 하 여 수행 막입니다. 이 HTS 분석 결과의 강력 하 고 간단한 프로토콜 우리 각 화면에 대 한 정도 79000 작은 분자의 활동을 탐구를 활성화. 그러나,이 HTS 분석 결과 발광 신호 읽기, 때문에 가양성 β-gal 억제제를 포함 하 여 색 또는 세포 독성 화합물 포함 되며 2 차 분석 결과 의해 식별 대기 히트 목록에.
전통적인 immunostaining 및 형광 이미징 방법 포유류 세포5,14,,1516의 rhodopsin 교통 공부를 몇 년 동안 사용 되었습니다. 그러나, 이러한 기존의 방법 신뢰할 수 있는 이미징 분석은 높게 일관 된 조건 하에서 촬영 한 이미지의 많은 수를 요구 하기 때문에 rhodopsin 전송으로 10 개 이상 화합물의 약리 효과 척도를 사용할 수 없습니다. 기존의 이미징 방법으로 하지 amendable. 여기, 우리 misfolded rhodopsin 돌연변이11,,1317의 셀 표면 수송 척도를 2 차 분석 결과 기반으로 하는 immunostaining이 콘텐츠 이미징 프로토콜 개발. 원형질 막에 rhodopsin 레이블을, 우리 생략 세포 막 permeabilization와 immunostained의 단계 rhodopsin 돌연변이 단일 클로 널 (b 6-30) 안티 rhodopsin 셀의 extracellular 측에 rhodopsin의 N 맨끝 epitope를 인식 하 여 막18. 전체 셀에 돌연변이 rhodopsin를 시각화 하려면 우리 rhodopsin 금성 형광 단백질을 융합. 다른 형광 채널에 형광 강렬의 정량화, 총 rhodopsin 강도 포함 하 여 전체 셀, 셀 표면에의 비율에에서 1 개의 단 하나 실험에서 여러 매개 변수를 얻을 수 있습니다. 세포 표면에는 전체 셀에서의 rhodopsin 형광 안정적인 6 misfolded rhodopsin 뮤턴트의 총을 표현 하는 세포에이 방법을 적용, 우리이 뮤턴트 쪽으로 여러 개의 작은 분자 보호자의 약리 프로 파일을 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 모든 셀 immunostained 384-잘 접시에 있으며 매우 일관 된 이미징 조건 하에서 자동된 이미징 시스템을 사용 하 여 몇 군데. 이미지 분석은 600 개 이상의 셀을 셀 모양 및 단백질 표정 수준 변화와 셀의는 인해 변화를 줄이기 위해의 이미지가 포함 된 각 잘 수행 됩니다. 이 프로토콜의 워크플로 그림 1에 요약 됩니다. 이 방법의 장점은 우리 이미지 기반 분석에서 고해상도 이미지 뿐만 아니라 다중 매개 변수 quantifications를 얻을입니다. 일반적으로,이 프로토콜 수정 하 고 계량 관심사의 어떤 misfolded 막 단백질의 수송에 적용 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 우리는 콘텐츠 이미징 분석 결과 조회 수는 HTS.에서 확인 대상이 사용 보였다 이러한 프로토콜에 관련 된 유일한 자동화 높은 콘텐츠 영상입니다. Immunostaining와 형광 이미징 rhodopsin의 rhodopsin5,14,,1516의 지역화 특성을 일반적으로 사용 되어 왔습니다. 그러나, 전통적인 이미징 방법으로 촬영 한 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
피츠버그 대학 신약 연구소이 콘텐츠 영상 및 초기 교육을 제공 하 고 우리 박사 마크 E. Schurdak를 감사 합니다. 아낌없이 박사 크 Palczewski (케이스 서쪽 예비 대학) 공유 하는 1D 4 및 B630 안티 rhodopsin 항 체. 마우스 rhodopsin 금성 건설의 cDNA를 포함 하는 플라스 미드는 박사 네 빈 램버트 (오 거 스타 대학)에 의해 공유 되었다. 이 작품은 피츠버그 대학 비전 연구 코어 보조금에서 YC를 P30EY008098 건강 그랜트 EY024992의 국립 연구소에 의해 지원 되었다.
Materials
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
References
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