En Rhodopsin Transport test av hög-innehåll Imaging analys
Summary
Vi beskrivit här, en hög-innehåll bildgivande metod för att kvantifiera transport av rhodopsin mutanter är associerad med retinitis pigmentosa. En multipel-våglängd scoring analys användes för att kvantifiera rhodopsin protein på cellens yta eller i hela cellen.
Abstract
Rhodopsin felveckning mutationer leder till rod ljusmätare döden som manifesteras som autosomalt dominerande retinitis pigmentosa (RP), en progressiv bländande sjukdom som saknar effektiv behandling. Vi hypotes att cytotoxiciteten felveckning rhodopsin muterade kan lindras genom att farmakologiskt stabilisera proteinet mutant rhodopsin. P23H mutationen, bland andra klass II rhodopsin mutationer, kodar ett strukturellt instabil rhodopsin mutant protein som ackumuleras i det endoplasmatiska retiklet (ER), medan den vilda typen rhodopsin transporteras till plasmamembranet i däggdjursceller celler. Vi har tidigare utfört en luminescence-baserade hög genomströmning skärm (HTS) och identifierade en grupp av farmakologiska chaperones som räddade transport av den P23H rhodopsin från ER till plasmamembranet. Här, kvantifieras med hjälp av immunfärgning metod följt av en hög-innehåll bildanalys, vi mutant rhodopsin protein mängden i hela cellen och plasmamembranet. Denna metod är informativ och effektivt att identifiera sanna träffar från falska positiva efter HTS. Dessutom, aktiverat den hög-innehåll bildanalys oss att kvantifiera flera parametrar från en enda experiment för att utvärdera de farmakologiska egenskaperna hos varje förening. Med denna analys, analyserade vi effekten av 11 olika föreningar mot sex RP associerade rhodopsin mutanter, erhålla en 2D-farmakologisk profil för en kvantitativ och kvalitativ förståelse om den strukturella stabiliteten i dessa rhodopsin mutanter och effekt av olika föreningar mot dessa mutanter.
Introduction
Protein Skellefteåsjukan är involverad i muskeldystrofi, neurala degeneration, samt förblindande sjukdomar, inklusive retinitis pigmentosa (RP)1. RP är en ärftlig och progressiv näthinneförtvining associerad med mutationer i över 60 gener som påverkar funktion och homeostas av rod fotoreceptorer eller retinal pigmenterad epitheliums (RPEs)2,3. Ingen effektiv behandling finns för närvarande för RP. Rhodopsin mutationer står för ca 25-30% av autosomalt dominant (ad) RP fall. Bland de mer än 150 rhodopsin mutationer4 (Human Gene Mutation databas, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), klass II mutationer orsaka strukturella instabiliteten av rhodopsin protein som bidrar till rod ljusmätare döden och Vision förlust5,6,7,8. P23H är mest frekventerar rhodopsin mutationen i Nordamerika, vilket är också ett typiskt exempel av klass II rhodopsin mutationer9,10. På grund av dess inneboende strukturella instabilitet ackumuleras den felveckning rhodopsin i det endoplasmatiska retiklet (ER) i däggdjursceller, medan den vilda typen rhodopsin ligger på plasmamembranet5. Den felveckning rhodopsin P23H mutant utställningar dominerande negativa cytotoxicitet som beror inte på haploinsufficiency, men är relaterad till aktivering av ER associerade protein nedbrytningsvägen och avbrutna staven yttre segmentet organisationen. För att lindra rod ljusmätare cell stress, är en strategi att stabilisera den infödda vikningen av den muterade rhodopsin som använder en farmakologisk förkläde.
För att uppnå detta mål, utfört vi en cellbaserade hög genomströmning skärmen (HTSs)11,12,13 med en β-galaktosidas fragment komplettering analys för att kvantifiera P23H rhodopsin mutant transporteras på plasma membran. Det robusta och enkla protokollet denna HTS analys aktiverat oss att utforska verksamhet ca 79.000 små molekyler för varje skärm. Men eftersom denna HTS analys läser luminiscens signaler, ingår falska positiva inklusive de β-gal-hämmare, färgade eller cytotoxisk föreningar i träfflistan väntar på att identifieras genom en sekundär analys.
Den traditionella immunfärgning och fluorescens avbildningsmetoder har använts i åratal för att studera rhodopsin transport i däggdjursceller5,14,15,16. Dock inte kan dessa konventionella metoder användas för att kvantifiera farmakologiska effekter av mer än 10 föreningar mot rhodopsin transport eftersom en tillförlitlig bildanalys kräver ett stort antal bilder som tagits under en mycket konsekvent villkora, som är inte ändras av de konventionella avbildningsmetoder. Här utvecklade vi en immunfärgning baserat protokoll hög-innehåll avbildning som en sekundär analys att kvantifiera cell surface transport av felveckning rhodopsin mutanter11,13,17. Etikettera rhodopsin på plasmamembranet, hoppade vi steget i cellmembranet permeabilisering och immunostained rhodopsin mutanter av en monoklonal anti (B6-30)-rhodopsin som erkänner den N-terminala epitop av rhodopsin på den extracellulära sidan av cellen membranet18. För att visualisera den muterade rhodopsin i hela cellen, smält vi rhodopsin med Venus fluorescens proteinet. Genom kvantifiering av fluorescens stödnivåerna i olika fluorescens kanaler har vi möjlighet att erhålla flera parametrar från en enda experiment inklusive totala rhodopsin intensiteten i hela cellen, på cellytan och förhållandet mellan rhodopsin fluorescens på cellytan som i hela cellen. Tillämpa denna metod för att stabila celler som uttrycker sammanlagt sex felveckning rhodopsin mutanter, kan vi generera en farmakologisk profil av flera småmolekylära chaperones mot dessa mutanter. I detta protokoll, alla celler är immunostained i en plattan med 384 brunnar och avbildas med hjälp av ett automatiserat imaging system under ett mycket konsekvent imaging tillstånd. En bildanalys utförs i varje brunn, som innehåller bilder av mer än 600 celler att minska variation på grund av heterogenitet av celler med olika form och protein uttryck cellnivå. Arbetsflödet i detta protokoll sammanfattas i figur 1. Fördelen med denna metod är att vi får högupplösta bilder samt multi-parameter kvantifieringar från image-baserad analys. I allmänhet, kan detta protokoll ändras och används för att kvantifiera transport av någon felveckning membranprotein av intresse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här, visade vi en hög-innehåll imaging test används för att karakterisera träffar identifierade från en HTS. Den enda automationen inblandade i dessa protokoll är hög-innehåll kameran. De immunfärgning och fluorescens avbildning av rhodopsin har använts allmänt att karakterisera localizationen av rhodopsin5,14,15,16. Kvantifiering av bilder tagna av de traditionella avbildningsmeto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Mark E. Schurdak och University of Pittsburgh Drug Discovery Institute för att tillhandahålla hög-innehåll imager och inledande träningar. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) delade generöst 1 d 4 och B630 anti rhodopsin antikroppar. Plasmiden som innehåller cDNA för mus rhodopsin-Venus construct delades av Dr Nevin Lambert (Augusta University). Detta arbete stöddes av National Institute of Health grant EY024992 till YC och P30EY008098 från University of Pittsburgh Vision forskning Core grant.
Materials
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
References
- Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. Protein misfolding and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).
- Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Stenson, P. D., et al. The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).
- Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).
- Athanasiou, D., et al. The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).
- Chiang, W. C., et al. Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration. Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).
- Sakami, S., et al. Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).
- Dryja, T. P., et al. Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa. New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).
- Sohocki, M. M., et al. Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies. Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).
- Chen, Y., et al. A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Chen, Y., Tang, H. High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation. Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).
- Chen, Y., et al. A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).
- Noorwez, S. M., et al. Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).
- Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation. Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).
- Kaushal, S., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Biochemistry. 33 (20), 6121-6128 (1994).
- Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa. Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).
- Adamus, G., et al. Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application. Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), (2010).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Bray, M. A., Carpenter, A., Sittampalam, G. S. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. Assay Guidance Manual. , (2004).
- Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain. Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).
- Krebs, M. P., et al. Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue. Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).
