Établir des lignées de cellules surexprimant DR3 afin d’évaluer la réponse apoptotique thérapeutique anti mitotique

Résumé

Établissant une lignée cellulaire stable surexprimant un gène d’intérêt d’étudier la fonction du gène peut être fait par stables clones unique de transfection-cueillette après les transfectants via une infection rétrovirale. Ici, nous montrons que les lignées de cellules HT29-DR3 générées de cette manière élucider les mécanismes par lequel la mort récepteur 3 (DR3) contribue à l’apoptose induite par antimitotiques.

Résumé

Étudier la fonction d’un gène d’intérêt est possible en manipulant son niveau d’expression, comme diminuant son expression avec des lignées cellulaires démontable ou augmentant son expression avec des lignées de cellules surexpression. Transfection stable et transitoire sont deux méthodes qui sont souvent utilisés pour l’expression des gènes exogènes. Transfection transitoire n’est utile pour l’expression à court terme, alors que transfection stable permet un gène exogène à intégrer dans le génome de la cellule hôte où il devra être exprimée en permanence. En conséquence, transfection stable est habituellement employée pour la recherche sur la régulation génétique à long terme. Nous décrivons ici un protocole simple pour générer une lignée cellulaire stable surexprimant le récepteur mort étiqueté 3 (DR3) à explorer la fonction DR3. Nous avons choisi des clones unique après une infection rétrovirale afin de maintenir l’homogénéité et la pureté des lignées cellulaires stables. Lignées cellulaires stables générées à l’aide de ce protocole rendent les cellules HT29 DR3-deficient sensibles aux drogues antimitotiques, reconstituant ainsi la réponse de l’apoptose dans les cellules HT29. En outre, l’étiquette d’indicateur sur DR3 compense l’absence de bons anticorps DR3 et facilite l’étude biochimique du mécanisme moléculaire par lequel les agents antimitotiques induisent l’apoptose.

Introduction

Expression de gène hétérologue est souvent employée pour étudier la fonction des gènes d’intérêt. Deux méthodes, transfection stable et transitoire, sont principalement utilisés dans les cellules et biologie moléculaire pour insérer un segment d’ADN ou d’ARN dans la cellule hôte^1,2. Transfectées transitoirement l’ADN ou l’ARN ne peut être passé les cellules filles, donc la modification génétique seulement peut être conservée que pendant une courte période de temps. En revanche, dans les cellules transfectées de façon stable, gène exogène est intégrés dans le génome de cellule hôte, maintenir son expression dan....

Protocole

Veuillez noter que toutes les expériences de souris décrits ici ont été approuvés et interprétés conformément aux institutionnels animalier et utilisation Comité (IACUC) à l’Université Tsinghua.

1. génération de lignées de cellules de surexpression DR3

1. Construire le plasmide pour expression DR3 (pMXs-IRES-DR3-FLAG) en insérant des ADNc DR3 complet avec 3 x drapeau à l’extrémité C-terminale en vecteur rétroviral pMXs-IRES-Blasticidine sur les sites de restriction de BamHI/XhoI.
2. La croissance de cellules de Plat-A dans les boîtes de 60 mm avec 4 mL de milieu de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM). Le lendemain, quand les ce....

Résultats

Une caractérisation des cellules HT29 exprimant de manière stable DR3 est illustrée à la Figure 1. Les clones expriment des niveaux variables de DR3, tandis que les cellules de type sauvage, qui servent comme témoin négatif, ne montrent pas l’expression du gène exogène. Ici, nous ne montrons que cinq clones, parmi lesquelles cloner 1 et 5 expriment le plus haut niveau de DR3. Nous avons choisi clone 1 et 5 pour les expériences suivantes.

Discussion

Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode pour produire des lignées cellulaires stables HT29-DR3. Les cellules HT29-DR3 fournissent un modèle pour étudier les mécanismes moléculaires par lesquels DR3 contribue à l’apoptose induite par des agents antimitotiques. Cette approche est souple et répétable. Pour assurer le succès de la procédure, quatre étapes clés du protocole ont besoin à prendre en considération. Tout d’abord, afin de produire un haut assez titre de virus, il est recommandé d’effectuer la transfection d’.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM	Invitrogen	C11965500BT	Complété par 10 % de FBS et 1 % de péniciline/streptomycine
Essai de viabilité cellulaire luminescente	Promega	G7571
Paclitaxel	Selleck	S1150
pMXs-IRES-Blasicidin	Cell Biolabs	RTV-016
Dimethyl sulfoxyde	Sigma	D2650
PBS	Invitrogen	C14190500BT
1,5-Diméthyl-1,5-diazaundécaméthylène polyméthobromure Santa	Cruz	sc-134220
; Réactif de transfection	Promega	E2311
Anticorps secondaire anti-souris	Jackson ImmumoResearch	115-035-166
Anticorps anti-Flag	Sigma	F-3165
Lignée cellulaire HT29 ATCC		HTB-38
plat-A Lignée cellulaire	Cell Biolabs	RV-102
PVDF Immobilon-P	Millipore	IPVH00010
Cylindre de clonage	Sigma	C1059
Imagerie cellulaire Lecteur multimode	Biotek	BTCYT3MV
CKX53 Microscope inversé	Olympus	CKX53
Plaques de culture cellulaire 12 puits	Nest	712001
60 mm Plaques de culture cellulaire	Nest	705001
15 mL Tubes à centrifuger	Nest
0,22 &mu ; Filtre à particules	Millipore	SLGP033RB
Centrifugeuse 5810 R	Eppendorf	5810000327
96 puits Microplaque en polystyrène blanc  ;	Corning	3903
Western ECL Substrat	BIO-RAD	1705060
ImageQuant LAS 4000	GE Healthcare	ImageQuant LAS 4000  ;
Shaker décolorant  ;	HINOTECH	TS-2000A
Blasticidin	InvivoGen	ant-bl-1
Compteur de cellules automatisé	BIO-RAD	TC 20
Opti-MEM I Sérum réduit	Medium Thermo Fisher	31985070

Trypsine-EDTA (0,25 %)Invitrogen 25200056 601052