הקמת שורות תאים Overexpressing DR3 כדי להעריך את התגובה אפופטוטיים להיפגע הרפוי אנטי-mitotic

Summary

הקמת קו יציב תא overexpressing הגן עניין ללמוד פונקציה ג'ין יכול להיעשות על ידי שיבוטים יחיד יציב של חיטוט תרביות תאים לאחר transfecting אותם באמצעות retroviral זיהום. הנה אנחנו מראים כי HT29-DR3 שורות תאים שנוצרו בדרך זו להבהיר את מנגנוני מוות איזה קולטן 3 (DR3) תורמת antimitotics-induced אפופטוזיס.

Abstract

לומד את הפונקציה של הגן עניין יכולה להיות מושגת על-ידי מניפולציה לרמת הביטוי, כגון הפחתת הביטוי שלה עם שורות תאים תמונות ציפורים או להגדיל את הביטוי שלה עם שורות תאים ביטוי. תרביות תאים ארעית ויציבה הם שתי שיטות שבהן משמשים לעתים קרובות על ביטוי גנים אקסוגני. תרביות תאים ארעי שימושית רק ביטוי לטווח קצר, ואילו תקנים יציב מאפשר גנים אקסוגני לשלב את הגנום של התא המארח היכן זה ברציפות יתבטא. כתוצאה מכך, תרביות תאים יציב בדרך כלל מועסק למחקר לתוך תקנה גנטי לטווח ארוך. כאן נתאר פרוטוקול פשוט כדי ליצור קו יציב תא overexpressing מוות מתויג קולטן 3 (DR3) לחקור פונקציה DR3. בחרנו שיבוטים יחיד לאחר זיהום retroviral על מנת לשמור על הומוגניות של טוהר השורות תא יציב. הקווים תא יציב שנוצר באמצעות פרוטוקול זה לבלתי DR3 לקויה HT29 תאים רגישים לסמים antimitotic, ובכך לשחזר את התגובה אפופטוטיים להיפגע בתאים HT29. יתר על כן, התג דגל על DR3 מפצה על אי זמינות של נוגדן DR3 טוב ואסטמה ומקילה על המחקר הביוכימי של המנגנון המולקולרי שבאמצעותו סוכנים antimitotic לגרום אפופטוזיס.

Introduction

ביטוי גנים heterologous הוא מועסק בדרך כלל ללמוד את התפקוד של הגנים של עניין. שתי השיטות, תרביות תאים ארעית ויציבה, משמשים prevalently תאים וביולוגיה מולקולרית כדי להוסיף מקטע של DNA או RNA^1,תא מארח². ה-DNA או RNA transiently transfected שאי אפשר לעבור לתאי הבת, אז שינוי גנטי יכול להישמר רק לתקופה קצרה של זמן. מצד שני, stably transfected תאים, גנים אקסוגני משולבים לתוך הגנום התא המארח, סופגת ביטויה של הקו הסלולרי. לפיכך, תרביות תאים יציבה היא שיטה זה שמורה בדרך כלל למחקר לתוך תקנה גנטי לטווח ארוך. גם יכול להיות מושתלים הקו הסלולרי יציב כמו xenografts לתוך עכבר מודלים עבור ויוו ללמוד^3....

Protocol

שימו לב: כל הניסויים העכבר המתוארים כאן היו אישר וביצע בהתאם טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת צינג.

1. דור של שורות תאים ביטוי DR3

1. לבנות את פלסמיד לביטוי DR3 (pMXs-IRES-DR3-דגל) על-ידי הוספת cDNA DR3 באורך מלא עם 3 x הדגל על קצה קרבוקסילי לתוך retroviral וקטור pMXs-IRES-Blasticidin באתרים מגבלת של BamHI/XhoI.
2. לגדל תאים Plat-A במנות 60 מ מ עם 4 מיליליטר הנשר של Dulbecco ששונה בינוני (DMEM). למחרת, כאשר התאים להגיע למפגש 80% - 90%, transfect את התאים עם 2 μg של פלסמיד pMXs-IRES-DR3-דגל באמצעות תקנים ריאגנט (ראה טבלה של חומרים) על פי היצרן ידנית²⁰.
<....

Results

אפיון של תאים HT29 stably לבטא DR3 מוצג באיור1. השיבוטים מביעים רמות משתנות של DR3, בעוד תאי פראי-סוג, אשר לשמש פקד שלילי, לא להראות ביטוי גנים אקסוגני. הנה אנחנו מראים רק שיבוטים חמש, ביניהם לשבט 1 ו- 5 express הרמה הגבוהה ביותר של DR3. בחרנו שיבוט 1 ו-5 על הניסויים הבאים.

המורפולוגיה של תאי HT29 ו- HT29-DR3 לאחר מתן של diazonamide נצפתה על ידי מיקרוסקופ הפוכה בהגדלה X 10 באיור.......

Discussion

כתב יד זה, אנו מתארים שיטה ליצירת שורות תאים יציב HT29-DR3. תאים HT29-DR3 מספקות מודל לימוד המנגנון המולקולרי שבאמצעותו DR3 תורמת אפופטוזיס המושרה על ידי סוכנים antimitotic. גישה זו היא תכליתי הדיר. כדי להבטיח ההצלחה של ההליך, ארבעה שלבים מרכזיים של הפרוטוקול צריך להיחשב. ראשית, על מנת לייצר גבוה מספיק כייל וירוס, מומלץ לבצע תרביות תאים DNA כאשר התאים Plat-A ב- 80% - 90% הנהרות. שנית, ההשעיה ויראלי לאחסנו ב 4 ° C עבור לא יותר מ 2 שבועות, מכוסה מהאור. שלישית, כאשר חלוקת התאים הנגועים מנות 150 מ מ, מומלץ לעשות דילולים טורי.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	C11965500BT	בתוספת 10% FBS ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין
בדיקת כדאיות תאים זוהרים	Promega	G7571
Paclitaxel	Selleck	S1150
pMXs-IRES-Blasicidin	Cell Biolabs	RTV-016
דימתיל סולפוקסיד	Sigma	D2650
PBS	Invitrogen	C14190500BT
Trypsin-EDTA (0.25%)	Invitrogen	25200056
1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide	Santa Cruz	sc-134220
מגיב טרנספקציה	Promega	E2311
נוגדן משני נגד עכבר	Jackson ImmumoResearch	115-035-166
נוגדן נגד דגל	Sigma	F-3165
HT29 קו תאים	ATCC	HTB-38
plat-A קו תאים	Biolabs	RV-102
PVDF Immobilon-P	Millipore	IPVH00010
צילינדר שיבוט	Sigma	C1059
קורא רב מצבי הדמיית תאים	Biotek	BTCYT3MV
CKX53 מיקרוסקופ הפוך	אולימפוס	CKX53
צלחות תרבית תאים 12 בארות	Nest	712001
60 מ"מ צלחות תרבית תאים	Nest	705001
צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל	Nest
0.22 μ מסנן סטרילי מ	Millipore	SLGP033RB
צנטריפוגה 5810 R	Eppendorf	5810000327
96 באר מיקרופלטת פוליסטירן לבנה	Corning	3903
Western ECL Substrate	BIO-RAD	1705060
ImageQuant LAS 4000	GE Healthcare	ImageQuant LAS 4000
שייקר הסרת צבע	HINOTECH	TS-2000A
Blasticidin	InvivoGen	ant-bl-1
מונה תאים אוטומטי	BIO-RAD	TC 20
Opti-MEM I סרום מופחת	תרמו פישר	31985070