Romanen processen för 3D utskrift cell-lösa matriser
Summary
Det här protokollet beskriver produktionen av polykaprolaktonuretangummi (PCL) glödtrådens med inbäddade polylactic acid (PLA) mikrosfärer som innehåller cell-lösa matriser (DM) för 3D-utskrifter av strukturella Vävnadsrekonstruktion konstruktioner.
Abstract
3D bioprinting syftar till att skapa anpassade ställningar som är biologiskt aktiva och plats för önskad storlek och geometri. En termoplast ryggrad kan ge mekanisk stabilitet liknar infödda vävnad medan biologiska agenter erbjuda kompositionella ledtrådar till stamceller, leder till deras migration, proliferation och differentiering för att rekonstruera de ursprungliga vävnaderna / organ1,2. Tyvärr många 3D utskrift kompatibel, bioresorbable polymerer (såsom polymjölksyra, PLA) är tryckt vid temperaturer över 210 ° C eller högre – temperaturer som är skadliga för biologics. Å andra är polykaprolaktonuretangummi (PCL), en annan typ av polyester, en bioresorbable, 3D utskrivbart material som har en mildare utskrift temperatur av 65 ° C. Därför, det antogs det cell-lösa extracellular matris (DM) som ingår i en termiskt PLA skyddsbarriär kunde skrivas inom PCL glödtråden och förbli i dess funktionell konformation. I detta arbete var osteokondrala reparation programmet som hypotesen testades. Som sådan, var svin brosk cell-lösa och inkapslade i polylactic acid (PLA) mikrosfärer som var därefter extruderas med polykaprolaktonuretangummi (PCL) till glödtråden att producera 3D-konstruktioner via smält nedfall modellering. Konstruktioner med eller utan mikrosfärerna (PLA-DM/PCL och PCL(-), respektive) utvärderades för skillnader i funktioner i surface.
Introduction
Aktuella tissue engineering tekniker för kliniska tillämpningar såsom ben, brosk, senor och ligament rekonstruktion använda auto- och organtransplantationer för att reparera skadad vävnad. Var och en av dessa tekniker utförs rutinmässigt som en ”gold standard” i klinisk praxis av första skörd givare vävnaden antingen från patienten eller en avlidna match och sedan placera givaren vävnaden in i fel plats2. Dessa strategier är dock begränsad av givare webbplats sjuklighet, givare webbplats knapphet för stora defekter, risk för infektion och svårt att hitta ympkvistar som matchar den önskade geometrin. Studier har dessutom visat att organtransplantationer används för återuppbyggnad har minskat mekaniska och biologiska egenskaper jämfört med infödda vävnad3. Med dessa i åtanke, har vävnad ingenjörer nyligen vänt sig till tre dimensionell (3D) bioprinting att producera anpassade, komplexa geometrier som är biologiskt aktiva och utformad för att rymma fel storlek och form samtidigt som den ger tillräcklig mekaniska egenskaper tills biologiska remodeling är klar.
Idealiskt, en 3D-tryckt byggnadsställning skulle bestå av en polymera ryggrad som kan behålla den nödvändiga mekaniska stabiliteten av infödda vävnad medan de inbyggda biologics erbjuder biokemiska signaler till omgivande celler, vilket leder till deras flyttning, spridning, differentiering och vävnad produktion2,5. Tyvärr, de flesta konstruktioner som innehåller biologiska komponenter gjorda med geler eller polymerer som är för svaga för att klara i vivo krafter upplevs av riktade vävnader för auto/transplantatavstötning återuppbyggnad. Andra polymerer, såsom polymjölksyra (PLA) är bioresorbable, 3D utskrivbara och ljud strukturellt, men skrivs ut vid temperaturer vid eller över 210 ° C – vilket gör det omöjligt för biologiska läkemedel ska Co tryckt under tillverkning. Polykaprolaktonuretangummi (PCL) är en annan FDA-godkänt, bioresorbable-polymer som kan vara 3D skrivas ut vid en lägre temperatur (65 ° C), som blivit allt populärare i fabricera patientspecifika implantat med komplexa morfologier5,6 ,7,8,9. Men gör de flesta bioprinters med pneumatisk teknik det omöjligt att skriva ut PCL vid lägre temperaturer där biologiska aktiviteter kan förbli oskadd. Hittills har dessa polymerer med auto/organtransplantationer integreras i en roman utskrivbara biomaterial ännu att vara fulländat. I avsaknad av sådant material är en sann vävnadstekniska inställning till vävnad rekonstruktion osannolikt. Därför, vi har försökt kombinera PLA, PCL, och cell-lösa transplantatavstötning matriser (DM) för att utnyttja fördelarna med varje material för att tillverka en livskraftig konstruktion kan rekonstruera komplexa vävnader. Denna process skulle ge den första mekaniska styrkan som krävs att motstå i vivo styrkor och termisk stabilitet att rymma additiv tillverkning i en konstruktion som inducerar bildandet av önskad vävnad.
I en senaste försök att ta itu med de ovannämnda hinder, visade vi att det är möjligt att kapsla in cell-lösa brosk extracellulärmatrix inom en termiskt PLA skyddsbarriär som kan vara pressad inom PCL filament, upprätthålla förmåga DM att påverka omgivande värd celler2. Detta har inspirerat oss att söka kliniskt effektiva metoder för vävnad rekonstruktion. I den aktuella studien använder vi den plattform tekniken för att bygga allt-i-ett-ställningar som inkluderar PLA, DM och PCL (PLA-DM/PCL).
Vårt mål är att förbättra effekten och nyttan av organtransplantationer med den föreslagna nya biofabrication tekniken för att mer exakt recapitulate infödda vävnad, för att slutligen använda dem i olika applikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Både cell-lösa matriser och 3D tryckta PCL ställningar har självständigt visat att möjliggöra vidhäftning och spridning av celler, validera deras användning för osteokondrala reparation10,11,12. Användning av cell-lösa matris i engineering approaches to vävnad reparera har varit föremål för mycket intresse och framgång i den nya förflutnan2,3,</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta projekt har delvis finansierats genom ett bidrag från den pediatriska ortopediska samhället av Nordamerika (POSNA) och National Institutes of Health bevilja NIBIB R21EB025378-01 (förberedande Bioengineering forskningsbidrag).
Materials
| Sieve machine | Haver & Boecker Tyler | Ro-Tap RX 29-E Pure | |
| Sieve 90 um | Fisherbrand | 170328156 | No. 170 |
| Sieve 53 um | Fisherbrand | 162513588 | No. 270 |
| Sieve 106 um | Fisherbrand | 162018121 | No. 140 |
| Sputter coater | Leica | n/a | |
| Scanning Electron Microscope | Hitachi, USA | n/a | |
| Filabot EX2 | Filabot.com | FB00061 | |
| Filabot Spooler | Filabot.com | FB00073 | |
| CAPA 6506 | Perstorp | 24980-41-4 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Gibco | 10010023 | |
| 6" Fan | Comfort Zone, Amazon | n/a | |
| Ultrasonic Water Bath | Cole Parmer | SK-08895-13 | |
| Dreamer | FlashForge | n/a | |
| Drum Mixer | Custom made | n/a | Similar piece of equipment: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= no&gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE |
| Micro Balance | Mettler Toledo, Fisher Scientific | 01-913-851 | |
| Simplify3D | Simplify3D | n/a | |
| SolidWorks | SolidWorks | n/a | |
| Microspheres | Produced in-house, see concurrently submitted JoVE submission | ||
| p-nitrophenyl phosphate, disodium salt, hexahydrate | Millipore | 4876-5GM | |
| Phosphatase, alkaline | Roche Diagnostics GmbH | 10 713 023 001 | |
| Absorbance Reader | Tecan | Sunrise | |
| Tris-HCl Buffer | Sigma-Aldrich | T6455-100ML | |
| Heated shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24 |
References
- Hutchmaker, D., Teoh, S., Zein, I., Ng, K. W., Schantz, J. -. T., Leahy, J. C. Design and Fabrication of a 3D Scaffold for Tissue Engineering Bone. Synthetic Bioabsorbable Polymers and Implants. 15 (2), 845-847 (1988).
- Ghosh, P., Gruber, S. M. S., Lin, C. -. Y., Whitlock, P. Microspheres containing decellularized cartilage induce chondrogenesis and remain functional after incorporation within a poly(caprolactone) filament useful for fabricating a 3D scaffold. Biofabrication. , (2018).
- Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
- Hutmacher, D. W. Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage. Biomaterials. 21 (24), 2529-2543 (2000).
- Kang, H., Hollister, S. J., La Marca, F., Park, P., Lin, C. -. Y. Porous biodegradable lumbar interbody fusion cage design and fabrication using integrated global-local topology optimization with laser sintering. Journal of biomechanical engineering. 135 (10), 101013-101018 (2013).
- Kang, H., Lin, C. Y., Hollister, S. J. Topology optimization of three dimensional tissue engineering scaffold architectures for prescribed bulk modulus and diffusivity. Structural and Multidisciplinary Optimization. 42 (4), 633-644 (2010).
- Lin, C. -. Y., et al. Functional bone engineering using ex vivo. gene therapy and topology-optimized, biodegradable polymer composite scaffolds. Tissue Engineering. 11 (9-10), 1589-1598 (2005).
- Lin, C. -. Y., Hsiao, C. -. C., Chen, P. -. Q., Hollister, S. J. Interbody Fusion Cage Design Using Integrated Global Layout and Local Microstructure Topology Optimization. Spine. 29 (16), 1747-1754 (2004).
- Zopf, D., Hollister, S., Nelson, M., Ohye, R., Green, G. Bioresorbable Airway Splint Created with a Three-Dimensional Printer. New England Journal of Medicine. 368 (21), 2043-2045 (2013).
- Pati, F., Song, T. H., Rijal, G., Jang, J., Kim, S. W., Cho, D. W. Ornamenting 3D printed scaffolds with cell-laid extracellular matrix for bone tissue regeneration. Biomaterials. 37, 230-241 (2015).
- Zhang, W., et al. The effect of interface microstructure on interfacial shear strength for osteochondral scaffolds based on biomimetic design and 3D printing. Materials Science and Engineering C. 46, 10-15 (2015).
- Williams, J. M., et al. tissue engineering using polycaprolactone scaffolds fabricated via. selective laser sintering. Biomaterials. 26 (23), 4817-4827 (2005).
- Monibi, F. A., Cook, J. L. Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioscaffolds: Emerging Applications in Cartilage and Meniscus Repair. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2017).
- Wiles, K., Fishman, J., Coppi, P., Birchall, M. The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions. Tissue Engineering Part B: Reviews. 22 (3), (2016).
- Sutherland, A. J., Detamore, M. S. Bioactive Microsphere-Based Scaffolds Containing Decellularized Cartilage. Macromolecular Bioscience. , (2015).
- Whitlock, P. W., Smith, T. L., Poehling, G. G., Shilt, J. S., Van Dyke, M. A naturally derived, cytocompatible, and architecturally optimized scaffold for tendon and ligament regeneration. Biomaterials. , (2007).
- Whitlock, P. W., et al. Effect of cyclic strain on tensile properties of a naturally derived, decellularized tendon scaffold seeded with allogeneic tenocytes and associated messenger RNA expression. Journal of surgical orthopaedic advances. 22 (3), 224-232 (2013).
- Whitlock, P. W., et al. A novel process for optimizing musculoskeletal allograft tissue to improve safety, ultrastructural properties, and cell infiltration. Journal of Bone and Joint Surgery – Series A. 94 (16), 1458-1467 (2012).
- Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Herman, I. M. Dynamic Reciprocity in the Wound Microenvironment. Wound Repair Regeneration. 19 (2), 134-148 (2012).
- Benders, K. E. M., van Weeren, P. R., Badylak, S. F., Saris, D. B. F., Dhert, W. J. A., Malda, J. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in Biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).
- Crapo, P., Gilbert, T., Badylak, S. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Guan, Y., et al. Porcine kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration. Materials Science and Engineering C. 56, 451-456 (2015).
- Dean, R. L. Kinetic studies with alkaline phosphatase in the presence and absence of inhibitors and divalent cations. Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (6), 401-407 (2002).
