Listeria monocytogenes Infektion i hjernen
Summary
Under infektion er Listeria monocytogenes i stand til at krydse blod – hjerne barrieren for at kolonisere hjernen. I denne protokol vise vi, hvordan man skal vurdere bakteriel kolonisering af organer efter infektion af mus. En procedure til at udføre hele orgel perfusion for specifikke bestemmelse af bakteriel numre i hjernen parenkym er fastsat.
Abstract
Listeria monocytogenes er en intracellulær bakteriel patogen, der er ofte knyttet til fødevarebåren infektion. L. monocytogenes evne til at passere blod – hjerne barrieren (BBB) er om da det kan føre til livstruende meningitis og encefalitis. BBB beskytter hjernen mikromiljø fra forskellige toksiske metabolitter og mikrobielle patogener i blodet efter infektion, og støtter derfor hjernen homøostase. De mekanismer, hvorved L. monocytogenes stede i blodbanen cross BBB kan forårsage hjernen infektioner ikke er fuldt forstået og der mangler også en robust modelsystem at studere hjernen infektioner af L. monocytogenes. Her præsenterer vi en simpel mus infektion model til at bestemme, om bakterier har krydset BBB og at kvantificere byrden af bakterier, der har koloniseret hjernen in vivo. I denne metode, dyr blev smittet intravenøst med L. monocytogenes og var humant aflives af eksponering til CO2 efterfulgt af cervikal dislokation. Hjerte perfusion af dyr blev udført før høst inficeret organer. Blodet blev indsamlet før perfusion og antal bakterier pr. orgel eller mL blod blev bestemt ved plettering fortyndinger af blod eller orgel homogeniseret på agar plader og tælle antallet af kolonier dannet. Denne metode kan bruges til at studere roman receptor-ligand interaktioner, der forbedrer infektion i hjernen af L. monocytogenes og nemt kan tilpasses for studiet af flere bakterielle patogener.
Introduction
Den Gram-positive bakterien Listeria monocytogenes er en fakultativ intracellulære patogen og en af de mest dødbringende levnedsmiddelbårne patogener på verdensplan. Indtagelse af L. monocytogenes forurenet fødevarer kan føre til listeriose i mennesker, en svær invasiv sygdom rettet mod det meste gravide kvinder, nyfødte, ældre og immunsvækkede personer1. L. monocytogenes er blandt de førende dødsårsager ved en levnedsmiddelbårne patogener i USA og sag trafikdræbt priser fra listeriose er så høje som 20-30%, det højeste til alle levnedsmiddelbårne patogener2. For L. monocytogenes findes der i øjeblikket ingen vaccine og evnen af bakterier til effektivt sprede sig til distale organer og hjernen ved at krydse blod – hjerne barrieren (BBB) kan føre til livstruende meningitis og kolonisering af hjernen3 , 4 , 5 , 6. bakteriel meningitis er typisk svær; mens de fleste mennesker, der modtager behandling genoprette, kan infektioner forårsage alvorlige komplikationer, fx, hjerneskade, høretab eller indlæringsvanskeligheder hos børn. L. monocytogenes er forudsagt for at tegne sig for mindst 10% af alle Fællesskabets erhvervede meningitis i USA ‘s7.
En vigtig rute for bakteriel formidling til hjernen og meninges er gennem blodbanen. Bakterier i omløb i blodkarrene i hjernen er i stand til at krydse BBB for at forårsage hjernen infektion. BBB er en yderst vaskulariserede barriere system, der beskytter hjernen mod fremmede partikler cirkulerer i blodet. Endotelceller udgør et lag, der linjer den indvendige overflade af blodkar8,9. Ud over L. monocytogeneser flere bakterielle patogener som Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coliog Haemophilus influenzae type b (Hib) i stand til at koloniserer hjernen ved at krydse BBB3,4,5,6. Når du undersøger bakteriel byrder i hjernen hos inficerede mus, er det imidlertid vigtigt at afgøre, om bakterier har krydset BBB, ellers den bakterielle byrde i hjernen kan repræsentere bakterier, der er stadig i blodkarrene i hjernen. Det er således nødvendigt at perfuse mus af blod før bestemmelse af kolonidannende enheder (CFU) af hjernen homogeniseret.
I denne undersøgelse beskriver vi i vivo metoder til at undersøge L. monocytogenes infektion i hjernen. For de metoder, der beskrives her, brugte vi L. monocytogenes stamme 10403S. L. monocytogenes 10403S er en af de mest udbredte laboratorium stammer at studere systemisk listeriose i musemodel af infektion10. Denne protokol er baseret på standard intravenøs injektion af L. monocytogenes efterfulgt af perfusion af mus. En skematisk oversigt over infektion protokol i mus er vist i figur 1. L. monocytogenes-inficerede hjerne og andre organer fra ikke-perfunderet eller perfunderet mus blev indsamlet og bakteriel orgel byrde fastlagt. Disse metoder er nyttige til at ikke kun bestemme samlede bakteriel kolonisering af hjernen i inficerede dyr, men er også gavnlig for at afgøre, om bakterier har trængt BBB i vivo at mægle invasion af hjernen. Det er vigtigt at understrege at dette laboratorium protokollen bør gennemføres efter samråd med de relevante institutionelle biosikkerhed udvalget og dyr bygningsforvaltning.
Protocol
Representative Results
Discussion
L. monocytogenes kan forårsage livstruende meningoencephalitis hos mennesker. Tidligere undersøgelser har vist evne til bakterier til at krydse blod-hjerne-barriere (BBB) og at kolonisere hjernen. Tre ruter af hjernen invasion har foreslået under infektion: direkte penetration af BBB af bakterier, stealth transport af bakterier indeholdt inde i mononukleære celler3og cytoskeletale migration af L. monocytogenes stammer, der forårsager rhombencephalitis15</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af US Public Health Service give AI103806 fra National Institutes of Health.
Materials
| Brain Heart Infusion media | Becton Dickinson | 237200 | |
| Streptomycin sulfate | Amresco | 0382-50G | |
| Petri dishes | VWR | 25384-342 | |
| Glycerol | VWR | 97062-832 | |
| IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenizer | IKA | 3352109 | Model: T18BS1 |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 series | |
| BALB/c mice | Jackson Laboratory | Model #000651 | |
| 1 mL syringes | Becton Dickinson | 309659 | |
| 26-gauge needles | Becton Dickinson | 305115 | |
| 21-gauge butterfly needles | Becton Dickinson | 367281 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60004 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 21008-918 | |
| Round-bottom test tubes | VWR | 60819-546 | |
| Phosphate-buffered saline | Corning | 46-013-CM | |
| Stainless steel spatula | VWR | 82027-520 | |
| Stainless steel scissors (6.5 in) | VWR | 82027-592 | |
| Stainless steel scissors (4.5 in) | VWR | 82027-578 | |
| Stainless steel blunt forceps (4.5 in) | VWR | 82027-440 | |
| Stainless steel fine tip forceps (6 in) | VWR | 82027-406 |
References
- Radoshevich, L., Cossart, P. Listeria monocytogenes: towards a complete picture of its physiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 32-46 (2018).
- de Noordhout, C. M., et al. The global burden of listeriosis: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Infectious Diseases. 14 (11), 1073-1082 (2014).
- Drevets, D. A., Leenen, P. J., Greenfield, R. A. Invasion of the central nervous system by intracellular bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 323-347 (2004).
- Huang, S. H., Stins, M. F., Kim, K. S. Bacterial penetration across the blood-brain barrier during the development of neonatal meningitis. Microbes and Infection. 2 (10), 1237-1244 (2000).
- Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. Epidemiology, diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clinical Microbiology Reviews. 23 (3), 467-492 (2010).
- Thigpen, M. C., et al. Bacterial meningitis in the United States, 1998-2007. New England Journal of Medicine. 364 (21), 2016-2025 (2011).
- Durand, M. L., et al. Acute bacterial meningitis in adults. A review of 493 episodes. The New England Journal of Medicine. 328 (1), 21-28 (1993).
- Disson, O., Lecuit, M. Targeting of the central nervous system by Listeria monocytogenes. Virulence. 3 (2), 213-221 (2012).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
- Kirchner, M., Higgins, D. E. Inhibition of ROCK activity allows InlF-mediated invasion and increased virulence of Listeria monocytogenes. Molecular Microbiology. 68 (3), 749-767 (2008).
- Grubaugh, D., et al. The VirAB ABC transporter is required for VirR regulation of Listeria monocytogenes virulence and resistance to nisin. Infection and Immunity. 86 (3), 901-917 (2018).
- Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
- Ghosh, P., et al. Invasion of the brain by Listeria monocytogenes is mediated by InlF and host cell vimentin. MBio. 9 (1), e00160-e00118 (2018).
- Henke, D., et al. Listeria monocytogenes spreads within the brain by actin-based intra-axonal migration. Infection and Immunity. 83 (6), 2409-2419 (2015).
- Maury, M. M., et al. Uncovering Listeria monocytogenes hypervirulence by harnessing its biodiversity. Nature Genetics. 48 (3), 308-313 (2016).
