Vivo में रेशम/aav फिल्मों का उपयोग कर optogenetic प्रोटीन की लक्षित अभिव्यक्ति
Summary
यहां, हम सिल्क फाइब्रोइन फिल्मों का उपयोग कर मस्तिष्क में वायरल अभिव्यक्ति वैक्टर देने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । इस विधि से अभिव्यक्ति वैक्टर के लक्षित वितरण रेशम/aav लेपित ऑप्टिकल फाइबर, पतला ऑप्टिकल फाइबर, और कपाल खिड़कियों का उपयोग करने की अनुमति देता है ।
Abstract
खोज कैसे तंत्रिका सर्किट प्रक्रिया जानकारी के क्रम में व्यवहार उत्पादन ड्राइव करने के लिए काफी हाल ही में विकसित किया गया है से छेड़छाड़ और vivo मेंंयूरॉंस की गतिविधि की निगरानी के लिए ऑप्टिकल तरीके से सहायता प्राप्त है । प्रयोगों के इन प्रकार के दो मुख्य घटकों पर भरोसा करते हैं: 1) implantable उपकरणों है कि मस्तिष्क के लिए ऑप्टिकल पहुँच प्रदान करते हैं, और 2) प्रकाश संवेदनशील प्रोटीन है कि न्यूरोनल उत्तेजना परिवर्तन या न्यूरोनल गतिविधि का एक readout प्रदान. प्रकाश के प्रति संवेदनशील प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए कई तरीके हैं, लेकिन वायरल वैक्टर के स्टीरियो टैक्सिक इंजेक्शन वर्तमान में सबसे लचीला दृष्टिकोण है क्योंकि अभिव्यक्ति को आनुवंशिक, शारीरिक और अस्थायी परिशुद्धता के साथ नियंत्रित किया जा सकता है । वायरल वैक्टर की महान उपयोगिता के बावजूद, ऑप्टिकल प्रत्यारोपण की साइट पर वायरस पहुंचाने कई चुनौतियां बन गया है । स्टीरियो टैक्सिक वायरस इंजेक्शन सर्जरी की मांग कर रहे हैं कि शल्य समय में वृद्धि, अध्ययन की लागत में वृद्धि, और पशु के स्वास्थ्य के लिए एक जोखिम मुद्रा. आसपास के ऊतक शारीरिक रूप से इंजेक्शन सिरिंज द्वारा क्षतिग्रस्त किया जा सकता है, और immunogenic उच्च टिटर वायरस के एक बोल्स के अचानक प्रसव के कारण सूजन द्वारा । मस्तिष्क में गहरे छोटे क्षेत्रों को लक्षित करते समय ऑप्टिकल प्रत्यारोपण के साथ इंजेक्शन aligning विशेष रूप से मुश्किल है. इन चुनौतियों को दूर करने के लिए, हम सिल्क फाइब्रोइन और adeno-जुड़े वायरल (aav) वैक्टर से बना फिल्मों के साथ ऑप्टिकल प्रत्यारोपण के कई प्रकार के कोटिंग के लिए एक विधि का वर्णन । फाइब्रोइन, bombyx मोरी के कोकन से व्युत्पंन एक बहुलक, encapsulate और जैव अणुओं की रक्षा कर सकते है और घुलनशील फिल्मों से मिट्टी के बरतन को लेकर रूपों में संसाधित किया जा सकता है । जब मस्तिष्क में प्रत्यारोपित, रेशम/aav कोटिंग्स ऑप्टिकल तत्वों और आसपास के मस्तिष्क के बीच इंटरफेस पर वायरस जारी, अभिव्यक्ति ड्राइविंग ठीक है जहां यह आवश्यक है । इस विधि को आसानी से लागू किया है और बहुत तंत्रिका सर्किट समारोह के vivo अध्ययन में सुविधा का वादा किया है ।
Introduction
पिछले दशक की निगरानी और तंत्रिका गतिविधि1से छेड़छाड़ के लिए इंजीनियर प्रकाश के प्रति संवेदनशील प्रोटीन का एक विस्फोट का उत्पादन किया है । वायरस मस्तिष्क में इन ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों को व्यक्त करने के लिए अद्वितीय लचीलापन प्रदान करते हैं । ट्रांसजेनिक जानवरों की तुलना में, वायरस अभी तक उत्पादन करने के लिए आसान कर रहे हैं, परिवहन, और दुकान, नवीनतम optogenetic उपकरणों के तेजी से कार्यान्वयन की अनुमति. अभिव्यक्ति आनुवंशिक रूप से विशिष्ट न्यूरोनल आबादी के लिए लक्षित किया जा सकता है, और वायरस प्रतिगामी परिवहन के लिए डिजाइन भी न्यूरोनल कनेक्टिविटी2के आधार पर अभिव्यक्ति लक्ष्य किया जा सकता है ।
वायरस आमतौर पर stereotaxic इंजेक्शन के साथ शुरू कर रहे हैं, जो समय लेने वाली और चुनौतीपूर्ण हो सकता है. संक्षेप में छोटे क्षेत्रों को लक्षित करना मुश्किल हो सकता है, जबकि व्यापक क्षेत्रों पर अभिव्यक्ति ड्राइविंग अक्सर कई इंजेक्शन की आवश्यकता है । इसके अलावा, जब एक ऑप्टिकल डिवाइस बाद में विवो मेंप्रकाश देने के लिए मस्तिष्क में प्रत्यारोपित किया जाता है, तो प्रत्यारोपण को वायरल इंजेक्शन के साथ ठीक से संरेखित होना चाहिए । यहां, हम एक प्रत्यारोपित डिवाइस के आसपास ऊतक को वायरल वैक्टर पहुंचाने के लिए एक आसानी से लागू विधि का वर्णन रेशम फाइब्रोन फिल्मों3का उपयोग कर । रेशम फाइब्रोइन वाणिज्यिक उपलब्ध है, अच्छी तरह से तंत्रिका ऊतकों द्वारा सहन, और विभिंन गुणों के साथ सामग्री का उत्पादन किया जा सकता है । सिल्क फिल्मों को माइक्रोइंजेक्शन पाइलेट या हैंड पिपेट जैसे आम प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग कर प्रत्यारोपण के लिए लागू किया जा सकता है । सिल्क/aav फिल्मों दो शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के लिए आवश्यकता को खत्म करने और सुनिश्चित करें कि वायरस-मध्यस्थता अभिव्यक्ति ठीक से ऑप्टिकल प्रत्यारोपण के लिए गठबंधन किया है. परिणामी अभिव्यक्ति फाइबर की नोक करने के लिए विवश है, और स्टीरियो टैक्सिक इंजेक्शन से फाइबर ट्रैक के साथ कम अवांछित अभिव्यक्ति में परिणाम.
छोटे फाइबर की नोक पर लक्षित अभिव्यक्ति के उत्पादन के अलावा, रेशम/aav फिल्मों के लिए व्यापक ड्राइव (> 3 मिमी व्यास) कपाल खिड़कियों के नीचे cortical अभिव्यक्ति इस्तेमाल किया जा सकता है । में vivo 2-फ्लोरोसेंट गतिविधि सेंसर की photon इमेजिंग संवेदी और संज्ञानात्मक प्रसंस्करण ड्राइविंग में न्यूरोनल गतिविधि की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए एक अनिवार्य उपकरण बन गया है. हालांकि, व्यापक cortical क्षेत्रों पर वर्दी अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए, experimenters अक्सर कई इंजेक्शन प्रदर्शन करते हैं । ये इंजेक्शन बहुत समय लेने वाला हो सकता है और दृश्य के क्षेत्र में असंगत अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसके विपरीत, रेशम/aav-लेपित कपाल खिड़कियों का निर्माण करने के लिए बहुत आसान कर रहे हैं, बहुत सर्जरी के लिए आवश्यक समय को कम, और सबसे उल्लेखनीय cortical सतह के नीचे माइक्रोन के अभिव्यक्ति सैकड़ों ड्राइव ।
Protocol
Representative Results
Discussion
aav का उपयोग रेशम/optogentic प्रोटीन की अभिव्यक्ति को लक्षित करने के दृष्टिकोण है कि वर्तमान में उपयोग में है की सीमाएं काबू । हालांकि कई अध्ययनों सफलतापूर्वक aav इंजेक्शन का उपयोग करने के लिए optogenetic प्रोटीन व्यक्…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों के चित्र के लिए जे vazquez शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, डी kaplan और अभिकर्मकों और सहायक मार्गदर्शन के लिए सी. preda, और बी के लिए sabatini और सी. हार्वे के लैब्स में vivo इमेजिंग । माइक्रोस्कोपी को एम. ओकाना और न्यूरोबायोलॉजी इमेजिंग सेंटर द्वारा संभव बनाया गया था, जो न्यूरल इमेजिंग सेंटर द्वारा न्यूरोलॉजिकल विकारों और स्ट्रोक (ninds) P30 कोर सेंटर ग्रांट (NS072030) के एक राष्ट्रीय संस्थान के हिस्से के रूप में समर्थित है । यह काम gvr खोदादाद परिवार फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था, नैन्सी lurie मार्क्स फाउंडेशन, और nih अनुदान द्वारा, ninds R21NS093498, U01NS108177 और ninds R35NS097284 डब्ल्यू जी आर करने के लिए, और एक nih postdoctoral फैलोशिप F32NS101889 द्वारा c.h.c.
Materials
| Aqueous silk fibroin | Sigma | 5154-20ML | Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films |
| Microinjector to deposit silk/AAV | Drummond | 3-000-207 | Nanoject III nanoliter injector |
| Manipulator to hold implants | Narashige | MM-33 | Micromanipulator |
| Stereoscope to visualize silk deposits | AmScope | SM-6TX-FRL | 3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light |
| Vacuum chamber to store implants | Ablaze | N/A | 3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber |
| Optional, implant holder for storage | N/A | N/A | To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block. |
| Optical fiber | Thorlabs | FT200EMT | Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants |
| Ferrules | Kientec | FZI-LC-230 | LC Zirconia Ferrule for fiber implants |
| Various materials for manufacturing chronic fiber implants | Various | N/A | For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68). |
| Tapered fiber implants | Optogenix | Lambda-B | Tapered fiber implants |
| GRIN lenses | GoFoton | CLH-100-WD002-002-SSI-GF3 | GRIN lenses |
| Small glass cranial windows | Warner | 64-0726 (CS-3R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Large glass cranial windows | Warner | 64-0731 (CS-5R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Various materials for manufacturing cranial windows | Various | N/A | For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515. |
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