In Vivo Riktade uttrycket av Optogenetic proteiner med hjälp av Silk/AAV filmer
Summary
Här presenterar vi en metod för att leverera viral uttryck vektorer i hjärnan med hjälp av silk fibroin filmer. Denna metod tillåter riktade leverans av uttrycket vektorer med silke/AAV belagda optiska fibrer, avsmalnande optiska fibrer och kraniala windows.
Abstract
Strävan att förstå hur neurala kretsar bearbeta information för att driva beteendemässiga utgång har varit kraftigt understödda av nyligen utvecklade optiska metoder för att manipulera och övervaka aktiviteten hos nervceller i vivo. Dessa typer av experiment är beroende av två huvudkomponenter: 1) implanterbara produkter som ger optisk åtkomst till hjärnan, och 2) ljuskänsliga proteiner som ändra neuronal excitabilitet eller ge en avläsning av neuronal aktivitet. Det finns ett antal sätt att uttrycka ljuskänsliga proteiner, men stereotaxic injektion av virala vektorer är för närvarande den mest flexibla metoden eftersom uttrycket kan kontrolleras med genetiska, anatomisk och tidsmässig precision. Trots den stora nyttan av virala vektorer, leverera viruset till platsen för optisk implantat innebär många utmaningar. Stereotaxic virus injektioner krävande operationer som öka kirurgisk tid, öka kostnaderna för studier och utgöra en risk för djurets hälsa. Omgivande vävnad skadas fysiskt genom injektionssprutan och immunogent inflammation som orsakas av abrupt leverans av en bolusdos på hög-titer virus. Justera injektioner med optisk implantat är särskilt svårt när inriktning små regioner djupt inne i hjärnan. För att övervinna dessa utmaningar, beskriver vi en metod för beläggning med flera typer av optiska implantat med filmer består av silke fibroin och Adeno-associerade virala (AAV) vektorer. Fibroin, en polymer som härrör från kokongen Bombyx Mori, kan kapsla in och skydda biomolekyler och kan bearbetas till former alltifrån lösliga filmer till keramik. När inopererad i hjärnan, släpper silke/AAV beläggningar virus i gränssnittet mellan optiska element och omgivande hjärnan, körning uttrycket just där det behövs. Denna metod implementeras enkelt och lovar att underlätta in-vivo studier av neural krets funktion.
Introduction
Det senaste decenniet har producerat en explosion av bakåtkompilerade ljuskänsliga proteiner för övervakning och manipulera neural aktivitet1. Virus ger oöverträffad flexibilitet för att uttrycka dessa optogenetic verktyg i hjärnan. Jämfört med transgena djur, är virus mycket lättare att producera, transportera och lagra, möjliggör snabb implementering av de nyaste optogenetic-verktyg. Uttryck kan riktas genetiskt distinkta neuronala populationer och virus konstruerade för retrograd kan även användas för att rikta uttryck baserat på neuronal anslutning2.
Virus introduceras vanligen med stereotaxic injektioner, som kan vara tidskrävande och utmanande. Exakt inriktning små regioner kan vara svårt, medan körning uttrycket över breda områden ofta kräver många injektioner. Dessutom när en optisk enhet är därefter inopererade i hjärnan att leverera ljus i vivo, måste implantatet anpassas med viral injektionen. Här beskriver vi ett enkelt implementerad metod för att leverera virala vektorer till vävnaden runt ett implantat med hjälp av silk fibroin filmer3. Silk fibroin är kommersiellt tillgängliga, tolereras väl av neurala vävnader och kan användas för att producera material med varierande egenskaper. Silk filmer kan tillämpas på implantat använder gemensamma laboratorieutrustning som Mikroskop pipetter eller hand pipetter. Silke/AAV filmer eliminera kravet på två kirurgiska ingrepp och säkerställa att virus-medierade uttryck är korrekt justerad till optiska implantatet. Det resulterande uttrycket är begränsad till spetsen av fibrer, och resulterar i mindre oönskade uttryck längs fiber spåret än stereotaxic injektioner.
Förutom att producera riktad uttryck på spetsen av små fibrer, silke/AAV filmer kan användas för att köra utbredd (> 3 mm diameter) kortikala uttryck under kraniala windows. In vivo 2-photon avbildning av fluorescerande aktivitetssensorer har blivit ett oumbärligt verktyg för att utvärdera rollen av neuronal aktivitet i körning sensoriska och kognitiv bearbetning. Däremot för att köra enhetligt uttryck över de breda kortikala områdena, praktiker ofta utföra flera injektioner. Dessa injektioner kan vara mycket tidskrävande och kan leda till inkonsekvent uttryck över synfältet. Däremot är silke/AAV-belagda kraniala windows extremt lätt att tillverka, kraftigt minska den tid som krävs för operationer och mest anmärkningsvärt drive uttryck hundratals mikrometer under kortikala ytan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Användning av silke/AAV att rikta uttrycket av optogentic proteiner övervinner begränsningar av metoder som för närvarande används. Även om många studier använder framgångsrikt AAV injektioner för att uttrycka optogenetic proteiner, är det utmanande att anpassa uttrycket till spetsen av optiska fibrer, till regioner runt längden på avsmalnande fibrer och till regionen visning av ett FLIN objektiv. Stereotaxic injektioner kan vara otillförlitliga på grund av förskjutning mellan optiska komponenter och opt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka J. Vazquez för illustrationer, D. Kaplan och C. Preda för reagenser och värdefull vägledning och labben B. Sabatini och C. Harvey för i vivo imaging. Mikroskopi möjliggjordes genom M. Ocana och neurobiologi Imaging Center, stöds delvis av Neural Imaging Center som en del av en nationell institut av neurologiska sjukdomar och Stroke (NINDS) P30 Core Center bevilja (NS072030). Detta arbete fick stöd av stiftelsen GVR Khodadad familj, Stiftelsen Nancy Lurie märken, och NIH grants, NINDS R21NS093498, U01NS108177 och NINDS R35NS097284 till W.G.R, och en NIH Postdoktorsstipendium F32NS101889 till C.H.C.
Materials
| Aqueous silk fibroin | Sigma | 5154-20ML | Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films |
| Microinjector to deposit silk/AAV | Drummond | 3-000-207 | Nanoject III nanoliter injector |
| Manipulator to hold implants | Narashige | MM-33 | Micromanipulator |
| Stereoscope to visualize silk deposits | AmScope | SM-6TX-FRL | 3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light |
| Vacuum chamber to store implants | Ablaze | N/A | 3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber |
| Optional, implant holder for storage | N/A | N/A | To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block. |
| Optical fiber | Thorlabs | FT200EMT | Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants |
| Ferrules | Kientec | FZI-LC-230 | LC Zirconia Ferrule for fiber implants |
| Various materials for manufacturing chronic fiber implants | Various | N/A | For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68). |
| Tapered fiber implants | Optogenix | Lambda-B | Tapered fiber implants |
| GRIN lenses | GoFoton | CLH-100-WD002-002-SSI-GF3 | GRIN lenses |
| Small glass cranial windows | Warner | 64-0726 (CS-3R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Large glass cranial windows | Warner | 64-0731 (CS-5R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Various materials for manufacturing cranial windows | Various | N/A | For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515. |
References
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Tervo, D. G., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Jackman, S. L., et al. Silk Fibroin Films Facilitate Single-Step Targeted Expression of Optogenetic Proteins. Cell Reports. 22 (12), 3351-3361 (2018).
- Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (68), e50004 (2012).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2011).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin sectioning of slice preparations for immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. (3), 194 (2007).
- Cao, Y., Wang, B. Biodegradation of silk biomaterials. International Journal of Molecular Sciences. 10 (4), 1514-1524 (2009).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
- Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nature Neuroscience. 13 (5), 584-591 (2010).
- Hines, D. J., Kaplan, D. L. Mechanisms of controlled release from silk fibroin films. Biomacromolecules. 12 (3), 804-812 (2011).
- Hu, X., et al. Regulation of silk material structure by temperature-controlled water vapor annealing. Biomacromolecules. 12 (5), 1686-1696 (2011).
- Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
- Yucel, T., Cebe, P., Kaplan, D. L. Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels. Biophysical Journal. 97 (7), 2044-2050 (2009).
- Wang, X., Kluge, J. A., Leisk, G. G., Kaplan, D. L. Sonication-induced gelation of silk fibroin for cell encapsulation. Biomaterials. 29 (8), 1054-1064 (2008).
- Lee, J., Park, S. H., Seo, I. H., Lee, K. J., Ryu, W. Rapid and repeatable fabrication of high A/R silk fibroin microneedles using thermally-drawn micromolds. European Journal of Biopharmaceutics. 94, 11-19 (2015).
