Summary
Daha önce bir sentetik peptid, akut akciğer iskemi reperfüzyon bağlı yaralanma azaltılmış protein kinaz C-delta inhibitörü intravenöz sunmak için bir altın nanopartikül peptid melez kullandık. İşte detaylı iletişim kuralı uyuşturucu formülasyon göstermektedir. Hücre içi diğer peptidler benzer şekilde formüle edilebilir.
Abstract
Protein kinaz C-delta inhibitörü (PKCδi) iskemi reperfüzyon bağlı organ yaralanması önlemek için umut verici bir ilaçtır. Genellikle bir hücre Penetran peptid, TAT, hücre içi teslimat için için Birleşik. Bununla birlikte, TAT non-spesifik biyolojik faaliyetleri göstermektedir. Altın nano tanecikleri (GNPs) olarak tanınan toksisite olmadan ilaç teslim taşıyıcılar kullanılabilir. Bu nedenle, PKCδi teslim etmek için bir GNP/peptid melez kullandık. İki kısa peptidler (P2: CAAAAE ve P4: CAAAAW), bir 95:5 oranında GNP yüzey özelliklerini değiştirmek için kullanıldı. PKCδi (GNP/PKCi) ile Birleşik GNPs distile su içinde kararlı %0.9 NaCl ve fosfat tamponlu tuz (PBS) sığır serum albümin veya fetal sığır serum içeren. İntravenöz enjeksiyon GNP-PKCi daha önce akciğerin iskemi-reperfüzyon hasarı önlemek için gösterildi. Bu makalede GNP/PKCi formüle ve GNP/PKCi physiochemical özelliklerini değerlendirmek için bir protokol özetlenmektedir. GNP peptid tabanlı diğer ilaçlarla formüle için benzer yöntemler kullandık. Bu makalede Umarım bu roman hücre içi uyuşturucu teslim teknoloji ve uygulamaları içinde vivo daha fazla dikkat çekecek.
Introduction
Akciğer nakli hastaların son aşama akciğer hastalığı1ile kaydeder. Ancak, akciğer nakli sonrası ciddi komplikasyonlar bir engel olarak kalır. Akciğer nakli takip erken aşamalarında birincil greft disfonksiyon en zararlı komplikasyon1ise onun birincil neden iskemi-reperfüzyon (IR)-Akut akciğer yaralanma2indüklenen.
Soğuk koruma altında bir donör akciğer metabolizmasında çok düşük bir düzeye sınırlıdır. Ancak, Reaktif oksijen türleri ve nitrik oksit sentezi kan akışı3kesilmesi nedeniyle aktif hale gelir. Ekimi sonra kan dolaşımını geri yüklenir ve Reaktif oksijen türlerine ve nitrik oksit soğuk iskemi sırasında oluşturulan doku yaralanma sonucu inflamasyon ve hücre ölüm artırır.
IR yaralanma önlemek için bir protein kinaz Cδ inhibitörü (PKCδi) kalp, beyin ve akciğer4,5,6,7,8' kullanılmıştır. Bu çalışmalar PKCδi reperfüzyon sırasında inflamasyon ve Apoptozis azalma gösterdi. Ayrıca akciğer IR yaralanma fareler ve akciğer nakli modeli6engelledi. PKCδi genellikle bir hücre Penetran peptid, TAT, hücre içi teslimat için ile Birleşik. Ancak, yalnız TAT peptid anjiogenezi, Apoptozis ve inhibisyon birden çok sitokinler9,10,11dahil non-spesifik biyolojik etkileri vardır gösterilmiştir. Nano tanecikleri, 1'den 100'e kadar küçük parçacıklar ilaç teslim13kolaylaştırma aday olarak keşfedilmeyi çapı12' nm. Özellikle, altın nano tanecikleri (GNPs) kadar noninvaziv ve toksik olmayan kabul edilir. Bu nedenle, uyuşturucu teslim taşıyıcıları peptid bazlı ilaçlara14,15olarak GNPs geliştirdik.
GNPs yüzeyinin Moleküler tanıma16,17, kimyasal algılama18, görüntüleme19ve ilaç dağıtım gibi belirli uygulamalar için manipüle edilebilir. 20 nm GNPs ve iki kısa peptidler içeren bir GNP/peptid hibrid sistemi geliştirilmiştir (P2: CAAAAE ve P4: CAAAAW) 95:5 oranında, GNPs yüzey özelliklerini değiştirmek için. P2 peptid, sonunda, olumsuz ücret glutamik asit (E) ile GNPs sulu bir çözüm stabilize ve P4 peptid, sonunda, hidrofobik triptofan (W) ile GNPs yardımcı olur giriş hücreleri14içine. Bu peptidler N terminus de sistein (C) kalıntı için altın yüzeyler14eşlenik thiol grubunu içerir. Bu peptid/GNP hibrid daha fazla PKCδi (CSFNSYELGSL) teslim etmek için kullanıldı. P2:P4 PKCδi için en iyi duruma getirilmiş molar oranını 47.5:2.5:50 var. PKCδi (GNP/PKCi) ile Birleşik GNPs distile su, % 0,9 NaCl ve sığır albümin veya fetal sığır serum14içeren PBS istikrarlı vardır. İntravenöz enjeksiyon GNP/PKCi akciğer15iskemi-reperfüzyon hasarı önlemek için gösterilmiştir. Bu makalede GNP/PKCi formüle etmek bir yöntem özetliyor ve GNP/PKCi fizikokimyasal özellikleri değerlendirmek açıklar. Diğer peptid bazlı ilaçlara GNP20,21,22' ye Birleşik formüle için benzer yöntemler kullandık. Umarız bu makale bu roman formülasyonu hücre içi ilaç dağıtım için daha fazla dikkat çekecek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hazırlanması peptid çözümleri
- Peptidler almak (P2: CAAAAE, P4: CAAAAW, PKCδi: CSFNSYELGSL)-20 ° C-dondurucu ve tezcan, oda sıcaklığında (RT).
Not: peptidler üzerinde Yoğuşmalı nem önlemek için kapalı şişe tutmak. - Her peptid 0,01 g bir microscale üzerinde tartın. Her peptid ayrı 50 mL konik tüp içine koymak.
- P2 tüp 18.74 mL deiyonize (DI) su ekleyin.
- DI su 16.93 mL P4 tüp ekleyin.
- PKCδi Tube DI suda seyreltilmiş % 50 Asetonitril 8.21 mL ekleyin.
- Girdap peptid çözümleri kısaca. 50 mL konik boru 5 min için bir sonicator (40 MHz) koyun.
- Peptid çözümleri bir biyogüvenlik kabine getir. Hazırlanan tüm peptid çözümler 1 mM olmalıdır.
- 1 mL her peptid çözeltisi için yeni 50 mL konik tüp aktarın. P2 ve P4 tüpler 19 mL DI su ekleyin ve öyle ki her çözüm için 50 µM seyreltilmiş ve kendi tüp içinde depolanan 19 mL % 50 Asetonitril PKCδi tüp için ekleyin.
2. GSMH/PKCi formülasyonu
- Peptidler GNP çözümde hala iken BSC eklenmelidir
- 475 μL P2, 25μL P4 ve δPKCi çözüm 500 μL 15 mL tüp içine ekleyin. 9 mL 20 nm GNP çözeltisi (7.0x1011 parçacık/mL) aynı 15 mL tüp ekleyin.
- Biyogüvenlik kabini çıkın. 15 mL tüp alüminyum folyo ile sarın. Bir shaker RT at üzerinde gece bırakın.
- Örnekleri için Biyogüvenlik kabini dönün. GNP/PKCi aliquot 1 mL her 1.5 mL mikrotüpler içine.
- Mikro santrifüj 15,294 x g 4 ° C'de 30 min için tüplerde santrifüj kapasitesi
- Süpernatant her tüpün altında bir biyogüvenlik kabini kaldırın.
Not: süpernatant GNP Pelet değişmeden kalır ve değil Aspire sağlarken kaldırmak için dikkatli olun. - Pelet gerekli toplama göre istenen solvent yeniden askıya. İlgili maddeleri olabilir DI su, PBS ve % 0,9 NaCl.
Not: GNP/PKCi 1 mL itibaren GNP Pelet üreticisi tarafından sağlanan GNP konsantrasyon göre 1011 parçacıklar x 6,3 içerir. 1.3 x 500 µL % 0,9 1012 parçacıklar yönetmek için NaCl, biz eklemek 232 µL % 0,9 NaCl her üç briketler. Onları birlikte havuzu sonra sonra 500 µL GNP/PKCi çözüm toplayabilirsiniz.
Not: istenen Mix solvent GNP/PKCi Pelet sulandrarak çok önce aksi takdirde GNP/PKCi toplamak.
3. GSMH/PKCi hibrid çözünürlük değerlendirilmesi
- 0.5 mL GNP/PKCi çözeltisi bir akrilik küvet dökün. Akrilik küvet bir UV-VIS Spektrofotometre yerleştirin ve en yüksek emme15sınayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bakım alınmalıdır GNP/PKCi Hybrid biyofiziksel özellikleri değerlendirmek için olarak GNP eğilimi solvent toplamak. GNP toplanır, belgili tanımlık eriyik rengini pembe mor (Şekil 1a) değişir. UV-VIS Spektrofotometre daha hassas değişiklikleri tespit edebilmektedir. Eğer GNP/PKCi değil toplanan emilme doruk-meli var olmak 525 nm (Şekil 1b). Eğer GNP toplanır, emme zirvesine sağa değiştirilecektir. Ne zaman toplamları ΔOptical yoğunluk oluşmuş analizi, alternatif bir yöntem olarak (ΔOD 525 OD = nm - OD, 440 nm) azaltır.
Resim 1 : GSMH/PKCi kalitesini. (A)düzgün hazırlanmış GNP/PKCi (solda) rengi pembedir. Toplanan GNP/PKCi görünür ışık (sağda) mor. (B) su, PBS, veya % 0,9 NaCl çözüm iyi GNP/PKCi hazırlık kararlı. Okuma bir UV-VIS Spektrometre üzerinde belirtilen emme zirvesine 525 olduğunu tüm çözümlerinde nm. (C) iyi ve kötü GNP/PKCi hazırlıkları bir örnek. GNP toplanan zaman emme zirvesine sağa doğru kaymıştır. Ayrıca, ΔOD düşmüştür. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uygun formülasyon emin olmak için δPKCi çözüm 1,6 olarak özetlenen sonication adım geçer önemlidir. ΔPKCi peptid sıra hidrofobik moieties, içeriyor, bu nedenle bir sonicator PKCi % 50 Asetonitril çözümde çözülmesinde yardımcı olur. Buna ek olarak, solvent titizlikle 2.7. adımda açıklandığı şekilde karıştırmak çok önemlidir. Eğer aşağıdaki adımları düzgün, δPKCi peptid23toplama nedeniyle bitmiş değil GNP/PKCi hibrid de formüle edilecektir değil.
Uyuşturucu GNP tabanlı formülasyon birçok avantaj sağlar. İlk olarak, GNPs kolayca birkaç nanometre ~ 100'e de kontrollü bedenleri, sentezlenmiş nm. Genellikle, daha küçük ölçekli GNPs uyuşturucu hücrelere küçük olanlar kolayca onların hedef bölge24diffüz gibi büyük olanlar daha verimli bir şekilde teslim edebilirsiniz. İkinci olarak, GNPs are non-toksik25tüp bebek ve içinde vivo, onları güvenli uyuşturucu taşıyıcıları yapım. Üçüncüsü, hidrofobik ilaçların değiştirilmiş GNPs26yüklenebilir. İleri, GNPs yüzey kimyası özel uygulamalar için kolayca değiştirilebilir. Çalışmalarımız, iki kısa peptidler onları fizyolojik şartlarda stabilize ve yeni bioactivities vermek için GNP yüzeyi, değiştirmek için kullanılır. Peptidler düşünceli altın bağlama, Aralık ve fonksiyonel bölgeler de dahil olmak üzere üç bölgeler ile dizayn edilmiştir. Özellikle peptid N terminus altınla bağlayabilirsiniz thiol grubu içeren sistein (C) kalıntı vardır. Orta bölümü dört hidrofobik alanin artıkları GNPs üzerinde yoğun paketlenmiş monolayer peptid derlemesinde tanıtmak için vardır. Bir fonksiyonel dışa, işaret GNPs yüzey özelliklerini işlemek için kullanılan Aminoasit C terminus adlı amino asittir. Bu iki peptidler 95:5 oranını sistemik bir önceki çalışmada14' seçildi. PKCi ve P2/P4 peptidler arasındaki oran da sistemik test edildi ve15seçili.
Öte yandan, GNP uyuşturucu dağıtım sistemi sınırlamaları vardır. GNPs hücre tipi ya da doku belirli değildir. GNPs esas olarak intravenöz yönetim27,28,29sonra akciğer, karaciğer ve dalak biriktirilir. Şimdiye kadar bu formül yalnızca hücre kültürü ve küçük hayvan sınanmıştır modelleri. Tercüme klinik uygulama, büyük hayvan modeller ve onun farmakokinetik daha fazla çalışmalar için doku dağıtım ve potansiyel toksisitesi gerek belirlenecek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bu proje üzerinde ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Kanada Sağlık Enstitüleri araştırma (PJT-148847), Bakanlığı araştırma ve yenilik, Ontario (RE-08-029) ve Kanada ilk araştırma mükemmellik programı, tasarım Toronto Üniversitesi Tıp araştırma hibe tarafından desteklenmektedir. Dr. Mingyao Liu James ve Mary Davie sandalye akciğer yaralanma, onarım ve yenileme olduğunu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| negatively charged glutamic acid peptide (P2) | CanPeptide | Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| hydrophobic tryptophan peptide (P4) | CanPeptide | Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| δPKCi peptide | CanPeptide | Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| Conical tube(50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
| Conical tube(15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
| Sonicator | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
| Microtube | Diamed.ca | AD 150-N | |
| Gold nanoparticle solution | Ted Pella | 15705-5 | A particle size is 20nm |
| Rocking Platform shaker | VWR international | 40000-304 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Acryl cuvette | SARSREDT | 67.758 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Agilent | Caty 60 UV-Vis |
References
- Yusen, R. D., et al. The registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: thirty-first adult lung and heart-lung transplant report--2014; focus theme: retransplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (10), 1009-1024 (2014).
- Lee, J. C., Christie, J. D., Keshavjee, S. Primary graft dysfunction: definition, risk factors, short- and long-term outcomes. Seminars in Respiratory and Critical. 31 (2), 161-171 (2010).
- Chatterjee, S., Nieman, G. F., Christie, J. D., Fisher, A. B. Shear stress-related mechanosignaling with lung ischemia: lessons from basic research can inform lung transplantation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (9), 668-680 (2014).
- Inagaki, K., et al. Inhibition of delta-protein kinase C protects against reperfusion injury of the ischemic heart in vivo. Circulation. 108 (19), 2304-2307 (2003).
- Lincoff, A. M., et al. Inhibition of delta-protein kinase C by delcasertib as an adjunct to primary percutaneous coronary intervention for acute anterior ST-segment elevation myocardial infarction: results of the PROTECTION AMI Randomized Controlled Trial. European Heart Journal. 35 (37), 2516-2523 (2014).
- Kim, H., et al. deltaV1-1 Reduces Pulmonary Ischemia Reperfusion-Induced Lung Injury by Inhibiting Necrosis and Mitochondrial Localization of PKCdelta and p53. American Journal of Transplantation. 16 (1), 83-98 (2016).
- Lin, H. W., et al. Derangements of post-ischemic cerebral blood flow by protein kinase C delta. Neuroscience. 171 (2), 566-576 (2010).
- Lin, H. W., et al. Protein kinase C delta modulates endothelial nitric oxide synthase after cardiac arrest. Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism. 34 (4), 613-620 (2014).
- Albini, A., et al. HIV-tat protein is a heparin-binding angiogenic growth factor. Oncogene. 12 (2), 289-297 (1996).
- Kim, H., Moodley, S., Liu, M. TAT cell-penetrating peptide modulates inflammatory response and apoptosis in human lung epithelial cells. Drug Delivery and Translational Research. 5 (3), 275-278 (2015).
- Lee, D., Pacheco, S., Liu, M. Biological effects of Tat cell-penetrating peptide: a multifunctional Trojan horse. Nanomedicine (Lond). 9 (1), 5-7 (2014).
- Auffan, M., et al. Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective. Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).
- Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M.
- Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 50 (41), 9643-9646 (2011).
- Lee, D., et al. Effective delivery of a rationally designed intracellular peptide drug with gold nanoparticle-peptide hybrids. Nanoscale. 7 (29), 12356-12360 (2015).
- Cheng, M. M., et al. Nanotechnologies for biomolecular detection and medical diagnostics. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (1), 11-19 (2006).
- Rosi, N. L., Mirkin, C. A.
- Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in chemical and biological sensing. Chemical Reviews. 112 (5), 2739-2779 (2012).
- Boisselier, E., Astruc, D. Gold nanoparticles in nanomedicine: preparations, imaging, diagnostics, therapies and toxicity. Chemical Society Reviews. 38 (6), 1759-1782 (2009).
- Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
- Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
- Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
- Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), (2014).
- Perrault, S. D., Walkey, C., Jennings, T., Fischer, H. C., Chan, W. C. Mediating tumor targeting efficiency of nanoparticles through design. Nano Letters. 9 (5), 1909-1915 (2009).
- Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small. 1 (3), 325-327 (2005).
- Kim, C. K., et al. Entrapment of Hydrophobic Drugs in Nanoparticle Monolayers with Efficient Release into Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 131 (4), 1360 (2009).
- Sonavane, G., Tomoda, K., Makino, K. Biodistribution of colloidal gold nanoparticles after intravenous administration: Effect of particle size. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 66 (2), 274-280 (2008).
- Balasubramanian, S. K., et al. Biodistribution of gold nanoparticles and gene expression changes in the liver and spleen after intravenous administration in rats. Biomaterials. 31 (8), 2034-2042 (2010).
- Lipka, J., et al. Biodistribution of PEG-modified gold nanoparticles following intratracheal instillation and intravenous injection. Biomaterials. 31 (25), 6574-6581 (2010).
