Efeito de proteínas fluorescentes na fusão parceiros usando Polyglutamine ensaios de toxicidade em levedura
Summary
Este artigo descreve os protocolos para avaliar o efeito de proteínas fluorescentes na agregação e toxicidade de misfolded polyglutamine expansão para a avaliação rápida de uma proteína fluorescente recentemente descaracterizada no contexto dos repórteres fluorescentes.
Abstract
Para a investigação de localização da proteína e tráfico utilizando imagens de células vivas, pesquisadores muitas vezes dependem de sua proteína de interesse para um repórter fluorescente de fusão. A lista em constante evolução de proteínas fluorescentes geneticamente codificadas (FPs) apresenta aos usuários com várias alternativas quando se trata de projeto de fusão fluorescente. Cada FP tem propriedades específicas de ópticas e biofísicas que podem afetar as propriedades bioquímicas, celulares e funcionais das fusões fluorescentes resultantes. Por exemplo, vários FPs tendem a formar oligómeros inespecíficos que são susceptíveis de impedir a função do parceiro de fusão. Infelizmente, apenas alguns métodos existem para testar o impacto de FPs sobre o comportamento do repórter fluorescente. Aqui, descrevemos um método simples que permite a avaliação rápida do impacto da FPs usando polyglutamine (polyQ) ensaios de toxicidade em brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae. Huntingtina expandido PolyQ proteínas estão associadas com o aparecimento da doença de Huntington (HD), onde a huntingtina expandida agrega em oligômeros tóxicos e corpos de inclusão. A agregação e a toxicidade do polyQ expansões em levedura são altamente dependentes as sequências flanqueando a região polyQ, incluindo a presença de etiquetas fluorescentes, proporcionando uma plataforma experimental ideal para estudar o impacto do FPs sobre o comportamento de seus parceiro de fusão.
Introduction
Desde a caracterização inicial da proteína verde fluorescente (GFP) de Aequorea victoria1, uma variada gama de FPs geneticamente codificado foram desenvolvidos, permitindo que biólogos da célula localizar e rastrear simultaneamente múltiplos eventos/proteínas celulares na vida células2,3. FPs são derivadas de vários organismos, de água-viva de coral e, portanto, a exibição Propriedades biofísicas específicas que desviam-se extensivamente para além de seu respectivo espectro fluorescente. Essas propriedades incluem o brilho, fotoestabilidade e uma tendência para oligomerize, entre outros,2,4. Selecionar monomérico FPs é um aspecto importante na seleção de uma marca adequada ao projetar um repórter fluorescente, a fim de minimizar interações inadequadas e alterações da função do parceiro fusão e maximizar a eficiência de repórter para uma dado compartimento celular4,5,6. Enquanto as boas práticas agrícolas, ao longo do tempo, sido evoluiu para minimizar o efeito de adicionar a tag fluorescente para a fusão parceiro5,7,8, como novas variantes FP executam em relação ao GFP continua a ser difícil de avaliar.
Existem alguns métodos para caracterizar o comportamento de FPs. A maioria deles envolve testar propriedades biofísicas de FPs usando abordagens bioquímicas, tais como ultracentrifugação e gel filtração protocolos9,10,11,12. Tais métodos têm a limitação do uso de FPs purificada em solução, oferecendo pequeno insight sobre seu comportamento nas células intactas. O desenvolvimento do retículo endoplasmático liso organizado (OSER) ensaio oferece uma avaliação quantificável da tendência de FPs’ a oligomerize em vida células13 , testando a capacidade de FPs Blumental de reorganizar os túbulos do retículo endoplasmático em Espirais OSER14. Esta técnica com êxito pode detectar alterações entre monoméricas e oligoméricas variantes de GFP e outros FPs. No entanto, baseia-se principalmente na superexpressão em células transfectadas transitoriamente, e a quantificação e análise de imagens podem ser demorados, a menos que a técnica é adotada como uma coleção de dados automatizada e fluxo de trabalho de análise.
A fim de complementar essas abordagens, estabelecemos um ensaio que se beneficia do efeito de etiquetas fluorescentes sobre a toxicidade e a agregação de expansões polyQ no fermento15,16. A expansão do trecho com mais de 36 polyQ repete dentro o primeiro exon de codificação do gene que da proteína huntingtina (Htt) está associada com a doença de Huntington17,18. A expressão de expandido Httex1 em resultados de levedura em um forte agregação da proteína Htt misfolded acoplada a um defeito grave de crescimento. Curiosamente, estes fenótipos são fortemente influenciados pelas sequências flanqueando o trecho polyQ, incluindo FPs15,16. Isso foi racionalizado que as diferentes propriedades de FPs diferencialmente podem afetar polyQ toxicidade no fermento. De fato, comparado ao GFP-como FPs, proteínas fluorescentes vermelhas e suas formas evoluídas mostraram uma reduzida toxicidade e agregação16. Este manuscrito fornece um protocolo detalhado para avaliar o efeito da próxima geração de FPs na toxicidade polyQ e agregação em levedura. Este ensaio permite uma análise rápida e potencialmente alto teor de variantes FP que pode ser usado em paralelo com anteriormente caracterizada técnicas para caracterização ideal de novo FPs e pode avaliar qual o seu desempenho em comparação com as boas práticas agrícolas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste artigo, vários ensaios para medir a agregação de Httex1 polyQ expansões e seu efeito sobre o crescimento de levedura foram utilizados como modelo para estudar como diferente fluorescente proteínas alteram seus parceiros de fusão no contexto dos repórteres fluorescentes . Usando uma variante GFP (ymsfGFP) como um controle positivo, mostramos que isso detecta alterações significativas de toxicidade polyQ e agregação entre diferentes etiquetas fluorescentes e permite uma comparação direta e rá…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo é suportado por uma subvenção de funcionamento de institutos canadenses para pesquisa em saúde para M.L.D. e paixao O trabalho aqui apresentado é suportado por um prêmio de John R. Evans líder fundo da Fundação Canadense para a inovação e um fundo correspondente do fundo de investigação do Ontário para paixao Y.J. é suportado por um MSc para bolsa de doutorado transferência do reitor da escola de Schulich M edicine e odontologia na Universidade de Ontário ocidental. S.D.G. é suportado por uma bolsa de doutorado do Canadá ALS.
Materials
| 5-alpha Competent E. coli (High efficiency) | New Englanfd Biolab | C2987 | |
| SpeI-HF | New Englanfd Biolab | R3133 | High fidelity enzymes are preferred |
| SalI-HF | New Englanfd Biolab | R0138 | High fidelity enzymes are preferred |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160 | |
| LB-Agar | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB-Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Ampicilin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600382 | |
| EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments inc | EPOCH2TC | |
| Yeast Pin Replicator | V&P Scientific inc. | VP407AH | |
| SPI imager | S&P Robotics inc. | spImager-M | |
| Zeiss LSM 800 confocal with AryScan | Carl Zeiss Microscopy | LSM 800 | |
| 8 well Lab-Tek imaging chambers | Fisher Scientific | 12565470 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Chemi Doc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| anti-FLAG M1 antibody | Sigma-Aldrich | F3040 | |
| Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody | Thermo | A32727 | |
| Plasmid MiniPrep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| Plasmid Gel extraction Kit | Fisher Scientific | K0831 | |
| PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Prizm | GraphPad | N/A | |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Fisher Scientific | BP13354 |
References
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
- Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design. Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nature Communications. 6, 7670 (2015).
- Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).
- Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Pédelacq, J. -. D., et al. Engineering soluble proteins for structural genomics. Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).
- Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).
- Pédelacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
- Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).
- Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions. Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).
- Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington’s disease. Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).
- Gusella, J. F., MacDonald, M. E. Huntington’s disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens. Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).
- Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations]. F1000Research. 7, 1242 (2018).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
- Duennwald, M. L. Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation. Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).
- Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae. Plos One. 8 (7), e67902 (2013).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
- Thomas, B. J., Rothstein, R. Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA. Cell. 56 (4), 619-630 (1989).
- Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
- Meriin, A. B., et al. toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).
- Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156 (1), 119-122 (1995).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
