استخدام تعزيز الفلورية الخضراء البروتين-الإعراب عن الإشريكيّة القولونية لتقييم البلعمه بلعم البريتوني الماوس
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لتقييم البلعمه بلعم البريتوني الماوس استخدام الفلورية الخضراء تعزيز البروتين-الإعراب عن الإشريكيّة القولونية.
Abstract
ويصف هذه المخطوطة طريقة بسيطة واستنساخه للقيام مقايسة البلعمه. الجزء الأول من هذا الأسلوب ينطوي على بناء ناقل الحيوانات الأليفة-سومو-اجفب (سومو = الصغيرة مثل أوبيكويتين المعدل) وإذ تعرب عن تعزيز البروتينات الفلورية الخضراء (اجفب) في الإشريكيّة القولونية (BL21DE). إذ تعرب عن اجفب كولاي هو كوينكوباتيد مع الضامة ح 1 في 37 درجة مئوية؛ هو المحتضنة مجموعة المراقبة السلبية على الجليد لنفس المقدار من الوقت. ثم، الضامة جاهزة للتقييم. وتشمل مزايا هذا الأسلوب في خطوات بسيطة وواضحة، والبلعمه يمكن أن يقاس مجهر سيتوميتير والأسفار كل تدفق. إذ تعرب عن اجفب كولاي مستقرة، وعرض إشارة قوية الأسفار حتى بعد أن يتم إصلاحها الضامة مع بارافورمالدهيد. هذا الأسلوب ليس فقط مناسبة لتقييم خطوط الخلايا بلعم أو الضامة الأولية في المختبر ولكن أيضا مناسبة لتقييم البلعمه المحببات والوحيدات في خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى. وتبين النتائج أن قدرة متجولة الضامة البريتوني من صغار الفئران (الأسبوع عمرها 8) أعلى من الضامة من الفئران (16 عاماً) الذين تتراوح أعمارهم بين. باختصار، هذا الأسلوب تدابير بلعم البلعمه وهو مناسبة لدراسة وظيفة نظام المناعة الفطرية.
Introduction
بلعم البلعمه سلالاته تستخدم غالباً لدراسة وظيفة المناعة الفطرية. الاستجابة المناعية الفطرية قد تشير إلى قابلية للإصابة. بلعم خطوط الخلايا تستخدم على نطاق واسع في دراسات علم المناعة. ومع ذلك، مرور الموسعة قد يؤدي إلى فقدان الجينات والشبهة وظائف المناعة في خطوط الخلايا هذه. وهكذا، الضامة البريتوني الأولية هي الكائن المثالي لدراسة وظيفة الخلية1.
رغم أنه يعتقد الاستجابة المناعية الفطرية سليمة في الجسم الذين تتراوح أعمارهم بين، قد إنقاص قدرة متجولة مقارنة بأن الهيئة في الأصغر سنا2،3. هنا، وسوف ندلل على أسلوب لتقييم البلعمه الضامة البريتوني من الشباب (ثماني أسبوع من العمر) والمسنين (16 شهرا) الماوس باستخدام التعبير عن اجفب كولاي، التي مريحة وسريعة ومجدية اقتصاديا.
استخدام عبئا معربا عن اجفب كولاي واحدة من مزايا هذا التحليل لهذه البكتيريا مستقرة وعرض إشارة قوية الأسفار، وحتى بعد أن يتم إصلاحها الضامة بواسطة بارافورمالدهيد 4% (w/v). بالإضافة إلى ذلك، باستخدام التعبير عن اجفب كولاي، لا يحتاج الباحثون كذلك تلطيخ بعد البلعمه، مما يوفر الوقت. وعلاوة على ذلك، يتم الضامة إيمونوريسبونسيفي كولاي مستضد السطحي، مما يجعل كولاي أكثر مناسبة للمقايسة البلعمه من استخدام الفطريات معربا عن اجفب أو الخرز المسمى فلوريسسين.
مع الإعراب عن اجفب كولاي، يمكن بسهولة إنجازه في ح 2 الإنزيم البلعمه وتقاس بكلا التدفق الخلوي والأسفار مجهرية، تبعاً للغرض للباحث. منذ مباشرة إجراءات هذا الأسلوب قدرة متجولة، النتائج أكثر استنساخه من الأساليب غير المباشرة الأخرى.
كما تم التحقق من هذا الأسلوب في خط خلية RAW264.7 وخلايا الدم الطرفية البشرية وحيدات النوى4. النص الموجود أدناه يوفر الإرشادات المفصلة خطوة بخطوة لإجراء هذا التحليل ويسلط الضوء على الخطوات الحاسمة التي قد تعدل الباحثون تلبية الاحتياجات للتجارب التي تقوم بها.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات المذكورة في هذا البروتوكول بسيطة جداً وواضحة. إحدى الخطوات الحاسمة للحث على التعبير اجفب كولاي. عادة، عندما يخطط مورثة من حقيقيات النوى، مثل اجفب، للتعبير عن في بدائيات النوى مثل كولاي، هناك خطر أن البروتين سوف تشكل مجاميع غير نشطة (إدراج الهيئات)، مما يؤدي إلى تغيير الب?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (رقم 31800046) ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة لياونينغ (رقم 20170540262) تؤيد هذا العمل. وأنجز هذا العمل في المختبرات التابعة لمركز البحوث العلمية في الجامعة “الثانية المستشفى من داليان الطبية”. المؤلف يود أن يشكر سانغ شياو لين لمساعدتها مع قياس التدفق، وتشو بو ويانغ دونغ تشوان لمساعدتها في إنتاج الفيديو.
Materials
| BD FACSCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | – | |
| Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | Cat101303 | |
| Champion pET SUMO Protein Expression system | Invitrogen | K300-01 | |
| Custom Gene Synthesis Service | Takara Biotech. | – | |
| DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher | D1306 | |
| F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS | Biolegend | Cat123110 | |
| Leica DMI3000 B Inverted Microscope | Leica Microsystems | – | |
| PE Rat IgG2a, κ-isotype control | Biolegend | Cat400507 | |
| Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution | AAT Bioquest | Cat23125 | |
| Thioglycollate medium | Sigma-Aldrich | T9032 |
References
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. Journal of Visualized Experiments. 98, e52749 (2015).
- Iskander, K. N., et al. Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding. Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).
- Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management. Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).
- Bicker, H., et al. A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria. Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).
- Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. Universal TA cloning. Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).
- Chen, Q., et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Weingart, C. L., et al. Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils. Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).
- Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species. Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).
- Ninkovic, J., Roy, S. High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization. Journal of Visualized Experiments. (93), e52195 (2014).
