להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום
Summary
הדמיה של קרום פלזמה מבודדים הן, אמצעי האחסון תאיים שמסביב, המיקרוסקופ המשוכלל כי היתר ברזולוציה גבוהה ומהירה יוצגו. השילוב של ספינינג דיסק וסיכום השתקפות פנימית פלורסצנטיות מיקרוסקופ בהגדרת אחד מאפשר ניסויים הדמיה חיה במחירים רכישה גבוהה עד 3.5 לשנייה בכל אוסף תמונות.
Abstract
בתאים חיים, תהליכים כגון היווצרות אדהזיה כרוך ביצוע שינויים מבניים נרחב קרום פלזמה ואת החלק הפנימי של התא. על מנת להמחיש את האירועים דינמי מאוד, חברו יחד שתי שיטות משלימות מיקרוסקופ אור לאפשר הדמיה מהיר של דגימות בשידור חי: ספינינג דיסק מיקרוסקופ (אס די) עבור ברזולוציה גבוהה ומהירה נפח הקלטה של החזרה גמורה מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (TIRF) עבור לוקליזציה מדויק והדמיה של קרום פלזמה. פרוטוקול דימות מקיף ושלם יוצג עבור המנחה דרך הכנת הדוגמא, מיקרוסקופ כיול, התמונה היווצרות ורכישה, וכתוצאה מכך צבע רב SD-TIRF בשידור חי סדרת הדמיה עם רזולוציה גבוהה-עתיים. כל השלבים עיבוד דפוס תמונה נחוץ ליצירת רב ממדית datasets הדמיה בשידור חי, כלומר רישום ושילוב של והערוצים, ניתנים במאקרו עצמית בכתב עבור תוכנת קוד פתוח ImageJ. ההדמיה של חלבונים פלורסנט במהלך החניכה, ההבשלה של מתחמי אדהזיה, כמו גם היווצרות של הרשת cytoskeletal אקטין, שימש הוכחה של עיקרון עבור גישה חדשנית זו. השילוב של מיקרוסקופיית תלת-ממד ברזולוציה גבוהה TIRF סיפק תיאור מפורט של התהליכים המורכבים האלה בתוך הסביבה התאית, באותו הזמן, לוקליזציה מדויק של מולקולות ממברנה-הקשורים מזוהה עם גבוה יחס אות-כדי-ברקע.
Introduction
הימים שלנו, מיקרוסקופ אור טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה/סופר ב קבוע מתן הדגימה החיה מפתחים במהירות. סופר-רזולוציה טכניקות כגון גירוי פליטה דלדול (STED), הבנוי תאורה מיקרוסקופ (SIM), צילום-הפעלת מיקרוסקופ לוקליזציה (דקל) או מיקרוסקופית ישירה סטוכסטי שחזור אופטי (סערה), בהתאמה, הם זמינים מסחרית ולאפשר הדמיה של מבנים subcellular מציג פרטים כמעט על סולם מולקולרית1,2,3,4,5,6. עם זאת, גישות אלה עדיין מוגבלת הישימות לניסויים הדמיה בשידור חי, שבו צריך כמויות גדולות, ניתן לאבחן עם מספר מסגרות לכל השני מהירות הרכישה. סוגים שונים של תהליכים דינאמיים מאוד מוסדרים דרך קרום פלזמה, למשל אנדו- / אקסוציטוזה, הדבקות, העברה או איתות, מתרחשות במהירות גבוהה תוך תאית בנפחים גדולים. לאחרונה, על מנת למלא את הפער הזה, טכניקה משולבת מיקרוסקופ היה המוצע ספינינג שנקרא דיסק-TIRF (SD-TIRF)7. בפירוט, מיקרוסקופ TIRF היתרי במיוחד לבודד, בתרגום של קרום פלזמה8,9, בעוד SD מיקרוסקופ הוא אחד של רגיש ביותר ומהיר לחיות טכניקות הדמיה הדמיה ומעקב של organelles subcellular10,הציטופלסמה11. השילוב של שתי טכניקות הדמיה בכיוונון יחידה כבר כבר הבנתי את העבר12,13, לעומת זאת, המיקרוסקופ המובאת כאן (איור 1) סוף סוף עונה על הקריטריונים כדי לבצע ניסויים SD-TIRF הדמיה בשידור חי התהליכים הנ ל- 3 מסגרות לכל השני מהירות. מאז מיקרוסקופ זה זמין מסחרית, המטרה של כתב יד זה היא לתאר בפרטים ולספק כלי קוד פתוח ופרוטוקולים ייבוא תמונות, רישום של ויזואליזציה הקשורים עם מיקרוסקופ SD-TIRF.
הגדרת מבוסס על מיקרוסקופ הפוכה מחוברת סריקה שתי יחידות באמצעות יציאות עצמאיות – הנמל שמאל קשורה יחידת SD והנמל בחזרה את יחידת הסורק עבור TIRF וצילום-הפעלה/הלבנת-ניסויים. עד 6 לייזרים (405/445/488/515/561/640 ננומטר) יכול לשמש עירור. עבור עירור וזיהוי של האות פלורסצנטיות, או 100 x / NA1.45 שמן או 60 x / NA1.49 שמן TIRF המטרה, בהתאמה, יש כבר מועסקים. האור הנפלט הוא מפוצל על ידי מראה ודיקרואיק זוהר (561 nm פס ארוך או לונג nm 514-מעבר…), מסוננים על ידי הלהקה לעבור מסננים שונים (55 ננומטר רחב מרוכז בכל 525 nm, 54 nm רחב מרוכז בכל 609 ננומטר על ידי קרינה פלואורסצנטית ירוק ואדום, בהתאמה) הניח לפני EM-CCD מצלמת שני תקופות. הינכם מתבקשים לשים לב כי לקבלת פרטים טכניים נוספים אודות הגדרת רשומים Zobiak. et al. 7. בתצורה TIRF, יחידת SD עזב את נתיב האור בתוך בערך 0.5 s כך שתי מצלמות אותו יכול לשמש לצורך זיהוי, ומאפשר מעבר מהיר יותר בין שתי שיטות הדמיה בהשוואה בסביבות 1 s שדווח בעבר13 . תכונה זו מאפשרת רכישה סימולטני ערוץ כפול, ובכך 4 ערוצי SD-TIRF הדמיה ב בעבר לא תואמות מהירות, דיוק יכול להתבצע. יתר על כן, יישור בין תמונות SD ו- TIRF אינה נחוצה. יישור תמונה בין שתי מצלמות, אך יש לבדוק לפני תחילת הניסוי, תוקן במידת הצורך. בפרוטוקול הבא, שיגרה תיקון הרישום בוצע במאקרו ImageJ עצמית בכתב. יתר על כן, המאקרו בעיקר נועדה לאפשר ויזואליזציה סימולטני של SD, TIRF datasets למרות שלהם dimensionality שונים. רכישת התוכנה עצמה לא סיפקו תכונות אלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
נייר זה הוצג יישומו המוצלח הראשון של מיקרוסקופיית SD ו- TIRF תצורה מתאים לביצוע ניסויים הדמיה התא בשידור חי, כלומר רכישה גבוהה המחירים כגון 2 SD-TIRF אוספי תמונות לדקה בשלב שונה 3 עמדות, המקביל סך של מסגרות 168 (בסביבות 3 מסגרות לשנייה), נרכשו. מיקרוסקופים SD-TIRF כמה שהיו שתוארה לעיל12<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים מאוד הקהילה המדעית של אוניברסיטת רפואי במרכז המבורג-גלאים לתמיכה אותנו עם דגימות להערכה. כלומר, אנחנו תודה סבין Windhorst תאי NIH3T3, אנדריאה Mordhorst עבור YFP-Vinculin ו- Maren רודולף עבור RFP-Lifeact.
Materials
| Microscope and accessories | |||
| SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
| Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
| Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
| Cell culture | |||
| HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
| Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
| Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | this publication | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
References
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Zobiak, B., Failla, A. V. Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane. Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).
- Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy. Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
- Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).
- Trache, A., Lim, S. -. M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024 (2009).
- Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Partridge, M. A. Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading. Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).
- Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
- Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner. Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).
- Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions. Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
- Chen, B. -. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
- Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).
- Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).
